反相离子对高效液相色谱法测定猪肉中呈味核苷酸

赵 艳，汪泓吉，张凤枰，杨发树，刘耀敏，范秀丽（通威股份有限公司水产畜禽营养与健康养殖农业部重点实验室，四川成都610041）

反相离子对高效液相色谱法测定猪肉中呈味核苷酸

赵 艳，汪泓吉，张凤枰，杨发树，刘耀敏，范秀丽
（通威股份有限公司水产畜禽营养与健康养殖农业部重点实验室，四川成都610041）

建立反相离子对高效液相色谱法测定猪肉中呈味核苷酸5'-尿苷酸二钠（5'-UMP）、5'-胞苷酸二钠（5'-CMP）、5'-鸟苷酸二钠（5'-GMP）、5'-肌苷酸二钠（5'-IMP）和5'-腺苷酸二钠（5'-AMP）含量的方法。应用ZORBAX SB-C18色谱柱，以0.01 mol/L KH2PO4溶液（含1.45 mmol/L四丁基硫酸氢铵，pH4.0）-乙腈（97∶3，V/V）为流动相进行洗脱，紫外检测器在254 nm处进行检测，外标法定量。结果表明，5种呈味核苷酸线性关系良好，相关系数均为0.9999，回收率在92.5%～106.0%范围内，相对标准偏差在1.75%～4.26%之间，5'-UMP、5'-CMP、5'-GMP、5'-IMP和5'-AMP检出限分别为2.0、2.0、2.0、3.0和3.0 mg/kg。该方法操作简便、灵敏度高、重现性好，适用于猪肉中呈味核苷酸含量的测定。

反相离子对高效液相色谱法，猪肉，呈味核苷酸

核苷酸是生物体内重要的低分子化合物，具有许多特殊的生理功能。很多食物中都含有一些天然的呈味核苷酸。5'-IMP、5'-GMP、5'-CMP、5'-AMP 和5'-UMP均具有强烈的呈鲜味作用，是已知能产生鲜美可口味道的重要化合物［1］。日本化学家Konosu等［2］对蟹肉、鲍鱼、海胆等的提取物进行了分析，认为食物的鲜味是在特定的条件下水溶性成分的复杂组合所产生的综合效应，但是主要的呈味成分是5'-核苷酸（IMP、GMP、AMP）和谷氨酸钠（MSG）。呈味核苷酸除了自身呈鲜味作用以外，还能与MSG协同作用，使鲜味明显地增强［3］，因此，测定食品中的呈味核苷酸含量对研究食品风味及呈味物质之间的相互关系有着重要的意义。

目前，呈味核苷酸测定的方法有分光光度法［4-5］、离子交换色谱法［6］、毛细管电泳法［7］、高效液相色谱法［8-10］、液相色谱质谱联用法［11-12］等。反相离子对高效液相色谱法是目前呈味核苷酸分析常用的测定方法，其特异性强、准确度高，可用于多种呈味核苷酸的同时分离检测，但目前还未见其应用于检测猪肉中五种呈味核苷酸有关报道。本文采用离子对反相高效液相色谱法对猪肉中的呈味核苷酸进行分离测定，并验证了方法的准确性和可靠性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪肉（肉眼） 通威送检样品；5'-CMP（99.95%）、5'-UMP（99.96%） 百灵威公司；5'-GMP（99%）、5'-IMP（98%）、5'-AMP（97%） sigma-Aldrich公司；乙腈（色谱纯） 美国Fisher公司；高氯酸、四丁基硫酸氢铵、磷酸二氢钾、氢氧化钾（均为分析纯） 国药集团化学试剂公司；水 为Milli-Q Gradient超纯水。

Alliance 2695高效液相色谱仪、2487紫外检测器、EMPOWER色谱管理系统 美国Waters公司；T10均质器 德国IKA公司；Allegra 64 R离心机 BECKMAN COULTER公司；KQ5200B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；CP224S电子分析天平 德国Sartorius公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 分别准确称取100 mg 5'-CMP、5'-UMP、5'-GMP、5'-IMP、5'-AMP，加纯水定容至100 mL容量瓶，配成质量浓度为1 mg/mL标准品储备液。将5'-UMP、5'-CMP、5'-GMP、5'-AMP配制成0.2、0.4、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL的系列标准溶液；5'-IMP系列标准溶液浓度为2.0、4.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL。

1.2.2 HPLC分析条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18色谱柱，150 mm×4.6 mm，5 μm；流速：1 mL/min；柱温：30℃；检测器：紫外检测器，波长为254 nm；进样体积：20 μL。流动相：0.01 mol/L KH2PO4（含1.45 mmol/L四丁基硫酸氢铵，K2HPO4调pH4.0）-乙腈（97∶3，V/V）。

1.2.3 供试样品溶液的制备 称取解冻好的猪肉2 g（精确至0.1 mg），置于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入冷的5%高氯酸10 mL，混匀，4℃冰箱放置1 h。取出后，均质30 s，匀浆液10000 r/min冷冻离心10 min，收集上清液，所得沉淀再用5%高氯酸提取、以10000 r/min冷冻离心10 min，合并两次上清液，用3 mol/L KOH溶液调pH至6.5，超纯水定容至50 mL，0.22 μm滤膜过滤，待高效液相色谱仪测定。

1.3 数据处理和分析

在相同的液相色谱条件下，分别将标准溶液和样品溶液注入液相色谱仪中，以保留时间定性，以试样峰面积与标准溶液峰面积比较定量。

2 结果与讨论

2.1 高效液相色谱分析条件的选择

2.1.1 色谱柱的选择 本实验采用Waters2695高效液相色谱仪，比较了SymmetryShieldTMC18色谱柱、μBondapakTMNH2柱和ZORBAX SB-C18色谱柱对呈味核苷酸的分离效果，发现SymmetryShieldTMC18色谱柱和氨基柱均不能很好的分离5'-GMP、5'-IMP，而使用ZORBAX SB-C18色谱柱（适用于较低pH的流动相）取得了良好的分离效果，结果见图1～图3。

2.1.2 流动相的选择

2.1.2.1 离子对试剂的浓度 选用四丁基硫酸氢胺浓度分别为1.30、1.35、1.40、1.45、1.50 mmol/L进行实验，发现浓度为1.45 mmol/L时分离效果最好，峰形对称，样品中的核苷酸与杂质峰完全分开，且该浓度较低，减小对色谱柱的影响。

图1 SymmetryShieldTMC18色谱柱分离图Fig.1 HPLC chromatogram of SymmetryShieldTMC18column

图2 μBondapakTMNH2柱的分离图Fig.2 HPLC chromatogram of μBondapakTMNH2column

图3 ZORBAX SB-C18色谱柱的分离图Fig.3 HPLC chromatogram of ZORBAX SB-C18column

2.1.2.2 磷酸二氢钾的用量 选用磷酸二氢钾浓度分别为0.005、0.01、0.03、0.05 mol/L进行实验，发现随着磷酸二氢钾浓度的增加，保留时间缩短，分离效果差异不大。但磷酸盐用量高时会导致液相色谱单向阀加速堵塞，影响检测，而用量低至0.005 mol/L时保留时间过长，峰形拖尾，所以选择磷酸二氢钾浓度为0.01 mol/L。

2.1.2.3 流动相pH的选择 由于磷酸基与离子对试剂在适合的pH下有较强的作用，可以使分析物得到较好的分离，使用四丁基硫酸氢铵，5种呈味核苷酸能完全分离。核苷酸属于酸性离子型化合物，在酸性条件下稳定，流动相的酸碱度决定了被分析物的解离状态，从而影响其与离子对的结合程度。因此，改变流动相的pH是改善分离选择性的有效方法。比较了pH为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.5的流动相，发现pH越大，出峰时间越靠后，且IMP和GMP越难分离，而pH为4.0时，分离效果最好，五种核苷酸能完全分离，又能不受样品中杂质的干扰。本实验在所选择的条件下，标准品分离效果见图4。

表1 呈味核苷酸的回归方程、检出限和定量限Table1 Linear regression equation，LOD and LOQ of five flavor nucleotides

表2 精密度实验（mg/100 g）Table2 Precisions for five flavor nucleotides（mg/100 g）

图4 呈味核苷酸标准品的色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of five flavor nucleotides

2.2 线性关系及检出限的考察

按照上述色谱条件进样，以峰面积对浓度绘制标准曲线。然后进行样品测定，以样品出峰信号的3倍信噪比计算检出限，以10倍信噪比计算定量限。线性方程、检出限和定量限见表1。

2.3 方法的精密度和回收率实验

为考察方法的精密度，对样品在相同条件下平行测定6次，结果见表2。由表2可见，样品中5'-UMP、5'-CMP、5'-GMP、5'-IMP和5'-AMP多次重复测定的相对标准偏差分别为1.61%、2.00%、1.53%、1.75% 和1.54%，表明该方法测定猪肉的呈味核苷酸，具有较高的精密度，重现性好。

为了研究方法的可靠性，在样品中分别添加2个浓度水平的标准溶液，每水平3个平行样，按照1.2.3样品溶液制备方法进行处理，按照1.2.2仪器条件进行测定，回收率结果见表3。结果显示，5'-UMP、5'-CMP、5'-GMP、5'-IMP和5'-AMP的回收率在92.5% ～106.0%范围内，相对标准偏差在1.75%～4.26%之间，符合实验要求。

表3 呈味核苷酸的回收率和测定的相对标准偏差（n=3）Table3 Spike recoveries and relative standard deviations for five flavor nucleotides（n=3）

2.4 猪肉中呈味核苷酸的测定

按照1.2.3样品溶液制备方法进行处理，对猪肉中的呈味核苷酸进行了提取，按照1.2.2仪器条件进行测定，得到猪肉中呈味核苷酸的HPLC图谱，见图5。

图5 猪肉中呈味核苷酸的色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of five flavor nucleotides in pork

考察物质对滋味的贡献大小不是取决于其含量的高低，而是取决于其呈味强度值（taste activity value，TAV），即呈味物质在样品中的含量与该化合物的味道阈值之比。如果某物质的TAV大于1，则说明该物质对滋味有重要贡献［3］。猪肉中的三种呈味核苷酸含量及其呈味强度值见表4。

由表4可知，猪肉中5'-IMP的含量很高（189 mg/ 100 g），而5'-UMP、5'-CMP、5'-GMP和5'-AMP含量均较低。从呈味强度值来看，5'-GMP、5'-IMP和5'-AMP的呈味强度值分别为0.29、7.56和0.16，说明5'-IMP对猪肉的滋味有重要贡献，而其他四种呈味核苷酸对猪肉的滋味贡献较小。

表4 猪肉中的呈味核苷酸含量及其呈味强度值（n=6）Table4 Contents and TAVs of five flavor nucleotides in pork（n=6）

3 结论

利用反相离子对高效液相色谱法测定猪肉中的呈味核苷酸，5'-IMP的线性范围为2.0～100.0 μg/mL，其他四种呈味核苷酸的线性范围为0.2～10.0 μg/mL，5种呈味核苷酸的回收率在92.5%～106.0%范围内，相对标准偏差在1.75%～4.26%之间，5'-UMP、5'-CMP、5'-GMP、5'-IMP和5'-AMP检出限分别为2.0、2.0、2.0、3.0和3.0 mg/kg。所建立的方法简便快速、重现性好、分离效果良好、灵敏度高、检测结果可信度高，可以满足猪肉中呈味核苷酸的检测需要。5'-IMP对猪肉的滋味有重要贡献。

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Determination of five flavor nucleotides in pork by ion-pair reversed-phase high performance liquid chromatography

ZHAO Yan，WANG Hong-ji，ZHANG Feng-ping，YANG Fa-shu，LIU Yao-min，FAN Xiu-li
（Key Laboratory of Aquatic，Livestock，Poultry Nutrition and Healthy Culturing，Ministory of Agriculture，Tongwei Co.，Ltd.，Chengdu 610041，China）

A method was established for the determination of five flavor nucleotides in pork by ion-pair reversedphase high performance liquid chromatography.Separation and quantification was achieved by using a ZORBAX SB-C18column，and a mobile phase of 0.01 mol/L KH2PO4solution（contain 1.45 mmol/L tetrabutylammonium hydrogen sulfate，pH4.0）-acetonitrile（97∶3，V/V）were used.The detection wavelength was 254 nm.The external standard calibration curves were used for quantification.There were good linear correlations for five flavor nucleotides（R2＞0.9999）.Average spike recovery of five flavor nucleotides was 92.5%～106.0%，with relative standard deviations 1.75%～4.26%，the limit of detection for 5'-UMP，5'-CMP，5'-GMP，5'-IMP and 5'-AMP being 2.0，2.0，2.0，3.0 and 3.0 mg/kg，respectively.This method was simple，sensitive，reproducible and suitable for the determination of flavor nucleotides in pork.

ion-pair reversed-phase high performance liquid chromatography；pork；flavor nucleotides

TS251.7

A

1002-0306（2016）02-0064-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.004

2015-05-06

赵艳（1983-），女，硕士，高级工程师，研究方向：水产品营养评价和食品及饲料产品质量安全检测，E-mail：zhao518yan@163.com。

四川省科技支撑计划项目（2011NZ0071）。