人参皂甙Rg1与坐骨神经损伤后修复相关性研究

冯慧琼，董峰.内蒙古包头医学院第一附属医院神经内一科，内蒙古包头　0400；.内蒙古包头包钢集团第三职工医院骨科，内蒙古包头　0400

人参皂甙Rg1与坐骨神经损伤后修复相关性研究

冯慧琼1，董峰2
1.内蒙古包头医学院第一附属医院神经内一科，内蒙古包头014010；2.内蒙古包头包钢集团第三职工医院骨科，内蒙古包头014010

目的 探讨中药人参皂苷Rg1（GsRg1）对大鼠坐骨神经损伤后恢复作用以及是否有局部释放神经生长因子的参与。方法 于2013年5月购买健康雄性Wistar大鼠，2月龄，共270只，随机均分为6组，每组45只。离断大鼠右侧坐骨神经后，立即在显微镜下缝合，左侧坐骨神经为空白对照，手术后，大鼠随机分为生理盐水组、GsRg1 2 mg、4 mg、8 mg、12 mg组和甲钴胺组，分别腹腔内注射，手术2、4、8周后，通过称量大鼠双侧小腿三头肌计算其湿重比率，据此评价坐骨神经再生和功能恢复情况；采用免疫组织化学和Western blot技术检测大鼠坐骨神经NGF表达的变化。结果①小腿三头肌湿重比，各GsRg1剂量组及甲钴胺组也明显高于生理盐水组，GsRg1组中4 mg组、8 mg组高于GsRg1其它2组及甲钴胺组，GsRg1 2 mg组、12 mg组与甲钴胺组小腿三头肌湿重比恢复相似。②NGF免疫组化及Western blot结果显示，GsRg1各组及甲钴胺组NGF表达明显高于生理盐水组。GsRg1 4 mg和GsRg1 8 mg组NGF表达多于甲钴胺组、GsRg1 2 mg组、12 mg组。甲钴胺组与GsRg1 2 mg组、12 mg组NGF表达相似。结论①GsRg1剂量为4 mg、8 mg的促神经再生和功能恢复作用优于剂量为2 mg、12 mg组。提示GsRg1促神经再生作用的最佳用药剂量为4～8 mg·kg。②GsRg1的促进受损神经功能恢复的作用与NGF因子密切相关。

人参皂苷Rg1；坐骨神经；神经损伤；神经再生；神经生长因子

［Abstract］Objective To observe whether the Rg1 can promote nerve function recovery after sciatic nerve injury and to investigate whether the partial release nerve growth factor participate in its mechanism,on the basis of which we can make a further study of its mechanism.Methods We use male Wistar rats for making a sciatic nerve injury model.february age,a total of 270,were randomly divided into 6 group,each group of 45.Under anesthesia,we amputate the right sciatic nerve of the rats and then stitch it up immediately under the surgical microscope,taking the left sided sciatic nerve as the blank control.After the surgery,They are saline group,GsRg1 2 mg group,Gs 4 mg group,Gs 8 mg group,Gs 12 mg group and Mecobalamin group.After 2 weeks,4 weeks and 8 weeks of surgery,we can weigh the Rat two-side triceps surae muscle measuring its wet weight ratio,we can evaluate the regeneration and functional recovery of the sciatic nerve；and detect the changes of NGF expression of sciatic nerve in rats with Immunohistochemistry and Western blot technology.Results①Triceps surae muscle wet weight ratio,each dose group of GsRg1 and Mecobalamin group is also significantly higher than Saline group,in GsRg1 group,4 mg group and 8 mg group are all higher than the other two groups of GsRg1,the recovery of GsRg1 2 mg group and 12 mg group are similar to nerve conduction velocity of Mecobalamin group and Triceps surae muscle wet weight ratio.②NGF Immunohistochemistry and Western blot results indicate that the NGF expression of GsRg1 groups and Mecobalamin group are higher than Saline group.The NGF expression of GsRg1 4 mg and GsRg1 8mg were more than Mecobalamin group,GsRg1 2 mg group and GsRg1 12 mg group.The NGF expression of Mecobalamin group is similar to GsRg1 2 mg group and GsRg1 12 mg group.Conclusion①GsRg1 could promote rat sciatic nerve transaction injury and enhance the nerve regeneration and functional recovery after surgical sutures；It suggests that the best dosage of GsRg1 for promoting nerve functional regeneration is 4～8 mg·kg.②The function of GsRg1 for promoting the recovery of injured nerve is related to NGF factor.

［Key words］Ginsenoside Rg1；Sciatic nerve；Nerve injury；Nerve rehabilitation；Nerve growth factor

人参是我国名贵的补益强壮养生佳品，李君庆等［1］人通过对人参皂甙Rg1抗神经细胞凋亡作用机制的研究发现人参皂甙Rg1抗神经元凋亡是通过抑制DNA的断裂发挥的作用。曾经有文献报道，Schwann细胞能够促进周围神经的损伤修复，同时研究表明研究表明，人参皂甙单体Rg1可促进Schwann细胞的分裂增殖及迁移［2］。张志军等［3］人等研究表明人参皂甙单体Rg1促进周围神经的损伤修复是通过影响内皮细胞的血管扩张及直接作用而完成的。上述资料进一步支持人参皂甙单体Rg1可促进周围神经的再生。该研究进一步明确人参皂苷Rg1是否能够促进离断后缝合的坐骨神经功能恢复；Rg1是通过什么途径促进已经离断的神经纤维修复再生；其发挥作用的机制中是否有NGF因子的参与，因此该研究对270只购买于2015年5月的健康雄性Wistar大鼠进行研究，明确 GsRg1能否进一步促进NGF蛋白的表达，从而促进损伤后的周围神经功能修复这一假设出发，利用已经成熟的坐骨神经离断后缝合技术制备大鼠损伤模型，进一步进行形态和功能上的研究，具体报道如下。

1　实验动物及方法

1.1实验动物分组及模型建立

健康雄性Wistar大鼠，2月龄，共270只，体重（275± 25）g,所有动物及饲料均购买自内蒙古大学动物实验中心，实验动物的许可证号为：SCXK（蒙）2002-0001，购回的大鼠先进行适应性饲养5～7 d，实验过程中对动物的操作方法均符合实验动物操作规定，符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。每只行右侧坐骨神经离断后纤维吻合，随机均分为6组，每组45只。4个实验组分别以2.0、4.0、8.0 mg/（kg·d）和12.0 mg/（kg·d）腹腔注射人参皂苷Rg1，阳性对照组腹腔注射100 mg/（kg·d）甲钴胺（Mecobalamin），阴性对照组注射生理盐水，均连续给药8周。每只大鼠右侧为损伤侧，左侧为正常对照。配置相关试验溶液。大鼠坐骨神经损伤模型的建立：成年雄性Wistar大鼠，用10%的水合氯醛腹腔注射（3 mL/kg），达到麻醉要求后，俯卧位固定大鼠、脱毛、消毒手术视野，在无菌条件下于右下肢股后部做一纵切口，长约1.5 cm，手术显微镜下无菌分离大腿的各肌层，充分显露并游离坐骨神经，后在梨状肌下缘0.8 cm处将坐骨神经离断，随即用无菌11-0无创伤尼龙线缝合，神经外膜处缝合4针，显微缝线留置于该损伤区外膜上作为标记，然后用无菌1-0线逐层关闭切口。所有操作均由一人完成。术后观察动物清醒后，分笼饲养，勤换垫料以防止足底溃疡发生。

1.2实验药物

人参皂甙Rg1由吉林大学生化教研室提供。甲钴胺（批准文号：国药准字H20050352，规格：0.5 m）g。1.3检测指标及方法

1.3.1小腿三头肌湿重（WWT）术后2、4及8周神经电生理检测后，完整取出大鼠双侧小腿三头肌并用分析天平称量，三头肌湿重恢复率＝（损伤侧WWT÷正常侧WWT）×%。

1.3.2坐骨神经远端组织进行NGF免疫组化检测术后2周时分别取吻合口远端及对侧坐骨神经给予固定、脱水、切片后，按照免疫组化试剂盒中的说明书中的方法法检测NGF蛋白，摄取图像，用图像分析软件对其结果进行处理。

1.3.3坐骨神经中NGF含量进行Western blot检测

①神经组织取材及蛋白提取：术后第2周无菌条件下切取远端坐骨神经10 mm后，裂解后离心制备蛋白样品并放入-80℃的冰柜中保存备用。

②蛋白含量测定：待测管蛋白含量＝待测管吸光度值/标准管吸光度值×10 mg/mL

③Western blot的具体实验步骤：先将分离胶及浓缩胶制备完成，待电泳槽安装完毕，取150 μg待测蛋白样品上样，于4℃环境下进行电泳，当溴酚蓝指示剂迁移到胶底约1 cm处停止电泳。随后进行胶块的漂洗；转膜；用5%脱脂奶粉封闭1h；封闭好的膜按照100μL/mm2的浓度，加入1：80的兔抗大鼠NGF一抗，对照组用1% PBS代替，后于4℃密封小袋内静置过夜；漂洗后进行免疫显影；对显色条带进行半定量分析。

1.4统计方法

将完整的临床资料和实验数据均输入计算机，运用SPSS 17.0统计学软件进行处理，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1小腿三头肌湿重恢复率（TSW）

分别于第2、4、8周神经电生理检测完毕后完，取出6组大鼠双侧小腿三头肌，于1/万分析天平（ESJ120-4型）称其重量，然后安装。三头肌湿重恢复率=（损伤侧WWT）÷正常侧WWT）×%计算出恢复率，结果见表1。

表1　各组小腿三头肌湿重恢复率不同时间的结果（±s）

表1　各组小腿三头肌湿重恢复率不同时间的结果（±s）

组别2周4周　8周盐水组（n=45）甲钴胺组（n=45）Gs2 mg组（n=45）Gs4 mg组（n=45）Gs8 mg组（n=45）Gs12 mg组（n=45）43.56±3.12 51.23±4.30 48.45±5.25 63.12±4.23 60.83±6.13 49.33±3.34 58.43±4.20 67.45±5.44 69.52±3.23 84.62±5.12 87.34±4.23 67.55±6.02 72.30±4.43 81.57±6.12 80.45±3.34 94.32±4.56 92.15±7.20 83.02±5.13

甲钴胺组及人参皂甙各组三头肌湿重恢复率在统计学上显著高于对照组（P＜0.01）。其中4 mg组及8 mg组显高于其他4组（P＜0.01）。4 mg组、8 mg组进行组间比较差异无统计学意义，甲钴胺组、2 mg组及12 mg组行组间相互比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2坐骨神经远端组织进行NGF免疫组化检测

各组进行NGF免疫组化检测（表2），可见2周时NGF阳性细胞在甲钴胺组和GsRg1中2 mg组，4 mg组，8 mg组，12 mg组比较多，与生理盐水组相比差异有统计学意义 （P＜0.01），NGF阳性细胞数在这5个组之间比较时发现GsRg1 4 mg组，8 mg组要明显多于甲钴胺组及GsRg1 4 mg组，8 mg组（GsRg1 4 mg组，8 mg 组P＜0.05）。

2.3坐骨神经中NGF含量进行Western blot检测

2周时进行各组的NGFWestern blot分析各组NGF因子表达含量的变化，结果见表2。可见在甲钴胺组和GsRg1组4 mg、8 mg组中，NGF表达含量较高，与其它3组相比差异有统计学意义。而在这3组内部比较，GsRg1组4 mg和8 mg组含量要高于甲钴胺组，差异有统计学意义 （P＜0.05）。而在生理盐水组与GsRg1组2 mg、12 mg各组之间差异无统计学意义。

表2　各实验组2周时进行NGF免疫组化及Western blot结果（±s）

表2　各实验组2周时进行NGF免疫组化及Western blot结果（±s）

注：▲与生理盐水组和GsRg1组2 mg、12 mg组比较P＜0.01；■与甲钴胺组比较，P＜0.05。

Groups（例数）　阳性细胞数所占比例%NGF蛋白表达的相对水平（μg/mLl）生理盐水组（45）甲钴胺组（45）GsRg1组2 mg（45）GsRg1组4 mg（45）GsRg1组8 mg（45）GsRg1组12 mg（45）15.64±8.33 （45.17±6.71）▲35.63±8.27 （55.22±6.24）▲■（58.34±3.10）▲■39.41±6.19 0.24±0.07 （0.63±0.12）▲0.26±0.02 （0.87±0.04）▲■（0.98±0.21）▲■0.33±0.04

3　讨论

人参皂甙Rg1是其中最为重要的单体之一，药理学作用相当广泛，尤其是人参皂甙Rg1的神经保护和营养作用更是受到关注。该研究结合临床及基础的最新研究，从周围神经损伤的治疗方面，以动物实验研究为主，对于大鼠的人参皂苷Rg1的剂量选择，我们参考其它国内的实验［4］，分别选择2、4、8、12 mg的剂量，便于药理学的分析，通过比较实验组三头肌湿重恢复率在统计学上显著高于对照组（P＜0.01）。其中4 mg组及8 mg组显著高于其他4组（P＜0.01）。4 mg组、8 mg组进行组间比较差异无统计学意义，甲钴胺组、2 mg组及12mg组行组间相互比较差异无统计学意义（P＞0.05）。各组进行NGF免疫组化检测，可见2周时NGF阳性细胞在甲钴胺组和GsRg1中4 mg组，8 mg组比较多，与其它3组相比差异有统计学意义，NGF阳性细胞数在这3个组之间比较时发现GsRg1组要明显多于甲钴胺组（P＜0.05），但在GsRg1组4 mg与8 mg两组间没有明显统计学差异。而在GsRg1剂量为2 mg、12 mg组和生理盐水组中阳性细胞数较少，但这3个组间比较NGF阳性细胞可见GsRg1组要多于生理盐水组，差异有统计学意义（P＜0.05）。2周时进行各组的NGF Western blot分析各组NGF因子表达含量的变化。可见在甲钴胺组和GsRg1组4 mg、8 mg组中，NGF表达含量较高，与其它3组相比差异有统计学意义。而在这3组内部比较，GsRg1 4 mg和8 mg组含量要高于甲钴胺组，差异有统计学意义（P＜0.05）。而在生理盐水组与GsRg1 2 mg、12 mg组之间差异无统计学意义。综上所述，浓度为4～8 mg的人参皂苷Rg1作用最为明显，显示这一范围的人参皂苷可以发挥比较好的促进神经功能恢复的作用。这一结果与国内周鹏等［5］人的结果相似，2 mg与12 mg组的GsRg1作用的效果较差一些，作用不如其它明显，其中4～8 mg组与临床常用的甲钴胺相比，其作用相当甚至优于甲钴胺，提示人参皂苷Rg1确实有促进周围神经功能恢复的特性，能够成为更好的促进周围神经生长的药物。但其具体参与调控的机制有待进一步的研究来揭示。根据研究报道［6-7］得知神经生长因子可以引发包括蛋白激酶C在内的信号转导，从而促进离子通道及结构原件的表达，这些离子通道及结构元件正是神经元分化和延长所必须的。由此可见NGF可以促进神经细胞突起的生长，对于周围神经离断后再缝合，细胞突起的生长也需要相应的营养物质的支持。国内文献报道证实［7］人参皂甙在神经神经因子缺少的培养液中可以促进PC12的轴突生长，同时对加入MPTP或SNK-SH细胞的培养液中具有营养和保护神经细胞的作用。同时研究证实人参皂甙可以增加海马区神经生长因子的mRNA的表达以及基底节区的胆碱乙酰基转移酶的mRNA的表达。在该研究中可见GsRg1组中神经组织中有NGF表达增多，其中以4 mg和8 mg组作用最强，其作用优于传统临床应用的甲钴胺的促神经功能恢复的作用，结合NGF的免疫组化与Western blot分析，显示这一作用与周围神经释放更多的神经生长因子有关，与国内其它研究学者的观点相近［8-13］。GsRg1治疗组促进神经功能康复效果优秀，期待后期更多的研究应用于临床的周围神经损伤疾病中。

结合该研究，随着生物学技术的发展及药理学的发展，对于人参皂苷对周围神经的营养作用也会逐渐增多，促进周围神经生长、神经功能恢复的药物的探索的报道也会越来越多。这也将会是下一步的研究方向。该课题创新性为在前期研究的基础上，采用大鼠坐骨神经建立动物实验模型，首次在体内系统地研究周围神经离断损伤并吻合术后，人参皂甙单体Rg1促进损伤神经再生和功能恢复的作用及其剂量效应关系、最佳有效治疗剂量和毒性剂量；同时探究其对损伤神经相关神经元存活、死亡和相关生物分子的影响，以及对Schwann细胞凋亡、增值和分泌功能的作用，进而阐明其作用机理。

4　结语

①GsRg1剂量为4 mg、8 mg的促神经再生和功能恢复作用优于剂量为2 mg、12 mg提示GsRg1促神经再生作用的最佳用药剂量为4～8 mg。②GsRg1的促进受损神经功能恢复的作用于NGF因子密切相关。

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The Experimental Study on Mechanism underlying the Promoted Regeneration of Injured Sciatic Nerve by Ginsenoside Rg1

FENG Hui-qiong1，DONG Feng2
1.Department of Neurology,The First Affiliated Hospital,Baotou Medical College,Baotou,Inner Mongolia,014010 China；2.Department of orthopaedics,Inner Mongolia baotou steel group,the third worker hospital,Baotou,Inner Mongolia,014010 China

R651.3

A

1674-0742（2016）08（a）－0001-05

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.22.001

冯慧琼（1985.10-），女，内蒙古包头人，硕士，主治

医师，研究方向：神经病学。

2016-05-09）