解淀粉芽孢杆菌Z16的产酶条件优化及应用

曾　诚,马毛毛,肖彦骏,3,*,曾哲灵,余　平,钟卫民

(1.南昌大学 第一临床医学院,江西南昌 330031;2.南昌大学 生命科学学院,江西南昌 330031;3.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;4.南昌大学 资源环境与化工学院,江西南昌 330031;5.抚州职业技术学院,江西抚州344106)



解淀粉芽孢杆菌Z16的产酶条件优化及应用

曾诚1,马毛毛2,肖彦骏2,3,*,曾哲灵3,4,余平4,钟卫民5

(1.南昌大学 第一临床医学院,江西南昌 330031;2.南昌大学 生命科学学院,江西南昌 330031;3.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;4.南昌大学 资源环境与化工学院,江西南昌 330031;5.抚州职业技术学院,江西抚州344106)

本文采用单因素实验和正交实验,对解淀粉芽孢杆菌Z16的产酶条件及水酶法提取樟树仁油工艺条件进行优化,并与枯草芽孢杆菌AS1.398的水酶法提取樟树籽仁油工艺进行比较。结果表明,解淀粉芽孢杆菌Z16的最佳发酵培养基为:玉米粉4.5%,麸皮2.5%,豆粕4.0%,CaCl20.2%,KH2PO40.03%,Na2HPO4·12H2O 0.4%,pH7.5,121 ℃灭菌20 min;解淀粉芽孢杆菌Z16的最佳发酵条件为:接种量2%,37 ℃、220 r/min,摇瓶培养44 h。在最佳产酶工艺条件下,解淀粉芽孢杆菌Z16所产中性蛋白酶活力为6984.3 U/mL,比产酶条件优化前提高了54.0%。解淀粉芽孢杆菌Z16水酶法提取樟树籽仁油的最适酶解时间为4 h、最适加酶量为20%(v/v),相应的樟树籽仁油得率为91.1%、樟树籽仁油的酸价升高值只有0.3 mg KOH/mL。解淀粉芽孢杆菌Z16的水酶法提取樟树籽仁油的效果显著优于枯草芽孢杆菌AS1.398(常用的中性蛋白酶生产菌)的效果。

解淀粉芽孢杆菌,中性蛋白酶,樟树籽仁油,水酶法

樟树籽仁油的中碳链脂肪酸甘油酯含量高于94%,具有减少体内脂肪沉积、降低血脂和血糖水平等作用[1-2]。中碳链脂肪酸甘油酯对枯草芽孢杆菌AS1.398等革兰氏阳性菌、霉菌及其所产生物酶具有较强的抑制作用[3-6]。水酶法提取油脂中使用的蛋白酶基本上是枯草芽孢杆菌AS1.398、栖土曲霉3942、放线菌166等菌株所生产的[7-8]。采用这些菌株所产的蛋白酶应用于樟树籽仁油的提取,其得率小于83%,酸价大于5 mg KOH/g。解淀粉芽孢杆菌Z16是产中性蛋白酶能力强、产脂肪酶能力很弱的耐中碳链脂肪酸型菌株,该菌株的产中性蛋白酶能力[9],比近年来文献报道的枯草芽孢杆菌N19[10-11]、枯草芽孢杆菌Bx-4[12]的产蛋白酶能力高很多,也高于国内常用于生产中性蛋白酶制剂的出发菌株——枯草芽孢杆菌AS1.398、栖土曲霉3942、放线菌166的产蛋白酶能力[13]。而解淀粉芽孢杆菌Z16的产脂肪酶活力大幅低于国内常用于生产中性蛋白酶制剂的出发菌株的产脂肪酶能力[9]。因此,解淀粉芽孢杆菌Z16适用于水酶法提取樟树籽仁油等中碳链油脂。本文对解淀粉芽孢杆菌Z16的产酶条件及水酶法提取樟树籽仁油工艺条件进行优化,实现樟树籽仁油的水酶法提取。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

解淀粉芽孢杆菌Z16课题组筛选获得;枯草芽孢杆菌AS1.398中国工业微生物菌种保藏管理中心;肉汤培养基蛋白胨1 g,牛肉膏0.3 g,NaCl 0.5 g,蒸馏水100 mL,pH(7.0±0.2),121 ℃灭菌20 min;基础发酵培养基[14-15]玉米粉4 g,麸皮2.5 g,豆粕3 g,KH2PO40.03 g,Na2HPO4·12H2O 0.4 g,蒸馏水100 mL,pH(7.0±0.2),121 ℃灭菌20 min;樟树籽仁(含油量57.96%)、玉米粉、麸皮、豆粕市售;Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、Na2CO3、NaCl、葡萄糖、三氯乙酸、乙醚分析纯,西陇化工有限公司;琼脂、干酪素、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉分析纯,天津大茂化学试剂厂;福林酚分析纯,上海荔达生物科技有限公司。

FA1604电子天平德国赛多利斯有限公司;XMT1-8112电热恒温水浴锅、TQZ-312型台式全温振荡器、全自动高压灭菌锅、SKP-02420型电热恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司;超净工作台吴江市净化设备总厂;HS-2F型pH仪上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂;TGL-16G高速离心机上海安亭科学仪器厂;WFZ765PC型紫外可见分光度计上海光谱仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1发酵培养基优化

1.2.1.1酶液的制作取一环活化好的菌株接种到肉汤培养基中,37 ℃、220 r/min 摇床培养24 h制得种子液。以4%的接种量将种子液加入到基础发酵培养基中,37 ℃、220 r/min摇瓶培养48 h后,8000 r/min离心10 min,上清液即为酶液。

1.2.1.2蛋白酶活力测定方法采用国家标准GB/T 23527-2009《蛋白酶制剂》中规定的福林酚法检测样品中的中性蛋白酶活力[16]。

1.2.1.3碳源和氮源种类对菌株产蛋白酶能力的影响将基础发酵培养基中的碳源(玉米粉)分别替换为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、甘油、柠檬酸钠;将基础发酵培养基中的氮源(豆粕)分别替换为蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硝酸钠、硫酸铵,其他条件同1.2.1.1,以基础发酵培养基为对照,分别测定各酶液的中性蛋白酶活力。

1.2.1.4玉米粉、麸皮、豆粕含量对菌株产蛋白酶能力的影响将基础发酵培养基中玉米粉的含量分别调整为3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%;麸皮含量分别调整为1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4.5%;豆粕的含量分别调整为2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%,其他条件同1.2.1.1,分别测定各酶液的中性蛋白酶活力。

1.2.1.5金属离子对菌株产蛋白酶能力的影响在基础培养基中分别添加0.1%(w/w)的CaCl2、ZnCl2、MgSO4·7H2O、FeSO4、Fe2(SO4)3、MnCl2,其他条件同1.2.1.1,以不添加任何金属离子的基础发酵培养基为对照,比较各组酶液中性蛋白酶活力。

1.2.2发酵条件优化

1.2.2.1培养基pH对菌株产蛋白酶能力的影响用HCl和NaOH分别将基础发酵培养基pH调节至5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9,其他条件同1.2.1.1,分别测定各酶液的中性蛋白酶活力。

1.2.2.2发酵温度对菌株产蛋白酶能力的影响将摇床温度分别调节为29、31、33、35、37、39、41 ℃,其他条件同1.2.1.1,分别测定各酶液的中性蛋白酶活力。

1.2.2.3接种量对菌株产蛋白酶能力的影响将接种量分别调整为1%、2%、3%、4%、5%、6%,其他条件同1.2.1.1,分别测定各酶液的中性蛋白酶活力。

1.2.2.4发酵时间对菌株产蛋白酶能力和菌体浓度的影响在发酵过程中每隔2 h检测发酵液的中性蛋白酶活力、菌体浓度。菌体浓度以稀释10倍的发酵液OD600计算。

1.2.3发酵培养基配方的正交实验优化以玉米粉、麸皮、豆粕和氯化钙含量为影响因子,设计L9(34)正交实验,以确定菌株发酵培养基的最佳配比,其他条件选取以上单因素实验的最优结果。正交实验因子与水平表列于表1中。

表1　培养条件正交实验因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal test for medium

1.2.4解淀粉芽孢杆菌Z16的水酶法提取樟树籽仁油取干燥至恒重的樟树籽仁与去离子水1∶4(w/w)加入到胶体磨中,湿法粉碎5 min,获得水乳液。以10%(v/v)的加酶量,将解淀粉芽孢杆菌Z16所产酶液加入到水乳液中,45 ℃保温4 h。将上述发酵液90 ℃保温10 min灭活,5000 r/min离心分离20 min。搜集下层渣相,70 ℃烘干至恒重,称重,并用索氏提取法测定其含油率。吸取上层油乳相,经冷冻解冻法破乳化后获得樟树籽仁油。采用国家标准(GB/T 5530-2005)《动植物油脂酸价测定方法》测定樟树籽仁油的酸价[17]。以灭活的淀粉芽孢杆菌Z16所产酶液为空白对照,以枯草芽孢杆菌AS1.398所产酶液为阳性对照。

樟树籽仁油得率计算方法:

式中,X为樟树籽仁油得率;M1和M2分别为樟树籽仁质量与残渣质量;C1和C2分别为樟树籽仁含油率和残渣含油率。

1.2.5解淀粉芽孢杆菌Z16的水酶法提取樟树籽仁油工艺条件优化

1.2.5.1酶解时间对樟树籽仁油得率的影响将1.2.4中的酶解时间分别调整为1、2、3、4、5、6 h,其他条件及操作步骤同1.2.4。每组做4个平行实验,分别检测各组樟树籽仁油得率。

1.2.5.2加酶量对樟树籽仁油得率的影响将1.2.4中的酶液添加量分别调整为5%、10%、15%、20%、25%,其他条件及操作同1.2.4。每组做4个平行实验,分别检测各组樟树籽仁油得率。

1.2.6数据分析数据表示采用四次测试所获的平均值±标准偏差。通过使用统计程序软件(SPSS 19.0)方差分析法(ANOVA分析)与随后的单独样品抽样t检测用来进行比较。如果p<0.05,则差异被认为是系统上显著。

2　结果与讨论

2.1解淀粉芽孢杆菌 Z16产酶条件优化

不同碳源和氮源对解淀粉芽孢杆菌Z16发酵产酶的影响结果如图1所示,由图1A可知,菌株产中性蛋白酶的最适碳源为玉米粉,当以蔗糖、淀粉等为碳源时菌株产酶能力较低。这是因为易于被微生物利用的碳源或氮源有助于细胞生长,难以被微生物直接利用的碳源或氮源则有助于产酶[13]。由图1B可知,培养基中的有机氮源较无机氮源更有利于菌株产酶,难以被利用的有机氮源比易于被利用的有机氮源更有利于菌株产酶。其中,菌株产中性蛋白酶的最适氮源为豆粕。

图1　碳源和氮源种类对解淀粉芽孢杆菌 Z16产中性蛋白酶能力的影响Fig.1　The effects of carbon resources and nitro resource on proteinase producing

玉米粉含量、麸皮含量和豆粕含量对解淀粉芽孢杆菌Z16产中性蛋白酶能力的影响如图2所示。由图2可知,玉米粉含量与豆粕含量对菌株产中性蛋白酶能力的影响较大,当玉米粉含量为4.0%～4.5%时,菌株产中性蛋白酶活力达到4600 U/mL以上;当豆粕含量为3.5%时,菌株产中性蛋白酶活力最高,为5822.2 U/mL。麸皮含量对菌株产中性蛋白酶能力的影响不大,当麸皮含量为3.0%时,菌株产中性蛋白酶活力最高,为5089.4 U/mL。这是因为玉米粉和豆粕分别是培养基中的主要碳源与主要氮源,两者含量的变化,都会对培养基的C/N产生较大的影响,从而影响菌株的产中性蛋白酶能力。麸皮含量对培养基C/N的影响不大,因而对菌株产中性蛋白酶能力影响也不大。

图2　豆粕、玉米粉、麸皮含量对解淀粉芽孢杆菌 Z16产中性蛋白酶能力的影响Fig.2　The effects of soybean meal,corn meal and wheat bran content on proteinase producing

金属离子、培养基pH、发酵温度和接种量对解淀粉芽孢杆菌Z16产中性蛋白酶能力的影响绘于图3中。由图3A可知,Ca2+、Mn2+有激活菌株产酶的作用,分别较空白组提高了17.7%和5.1%。因为Ca2+有促进菌体生长、增加中性蛋白酶的稳定性而减少中性蛋白酶自溶的作用[13],Mn2+是该中性蛋白酶中的活性中心。

由图3B可知,当培养基的pH低于7或者超过7.5时,菌株的产中性蛋白酶能力显著下降,培养基pH为7.5时菌株产酶能力最高,达5250.4 U/mL。因为培养基的pH会影响菌体的形态和代谢产物的合成途径,从而影响菌体的产酶量。由图3C可知,发酵温度为37 ℃时,菌株产中性蛋白酶能力最高,为5593.4 U/mL。发酵温度过低,不利于菌株生长;发酵温度过高,菌株衰老加快、蛋白酶稳定性变差、蛋白酶自溶增加,酶活力迅速降低。由图3D可知,接种量为2%时,菌株产酶能力最高,为5826.2 U/mL。通常情况下,接种量越大,延滞期越短,然而接种量过大使得培养基中的营养物质过快地被消耗,代谢废物增多,抑制菌株产酶[13]。

图3　金属离子、培养基pH、发酵温度、接种量 对解淀粉芽孢杆菌Z16产中性蛋白酶能力的影响Fig.3　The effects of meal icons,pH,temperature and inoculum size on protease producing

由图4中的菌体浓度曲线可以看出,解淀粉芽孢杆菌Z16细胞生长的迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期分别为0～20,20～30,30～50和50 h之后。由图4中的酶活力曲线可以看出,解淀粉芽孢杆菌Z16发酵时间达到12 h后,中性蛋白酶活力开始迅速增高,因为菌体细胞生长进入迟缓期的后期,菌体开始大量分泌胞外蛋白酶分解环境中的蛋白质,以获得足够的氨基酸,为细胞快速分裂做准备。发酵时间达到44 h,中性蛋白酶活力达到最大值,为4695.9 U/mL。发酵时间达到44 h后,中性蛋白酶活力开始降低,因为菌体细胞生长开始进入稳定期的后期,培养基中诱导菌株产蛋白酶的营养物基本被消耗,导致菌株产中性蛋白酶能力降低。发酵时间达到50 h后,中性蛋白酶活力开始快速降低,细胞生长进入衰亡期,菌体细胞死亡加速,影响中性蛋白酶活力的胞内物质释放到培养基中,加速了中性蛋白酶的自溶,导致中性蛋白酶活力迅速降低。对比上述两条曲线也可知,该菌株产胞外中性蛋白酶与细胞生长是同步进行的。

图4　解淀粉芽孢杆菌Z16发酵曲线Fig.4　The fermentation curve of Bacillus amlollquefaciens Z16

由表2可知,各因素影响作用按大小排列为:A>D>C>B。对正交实验结果方差分析可知,FA>FD>FC>FB,即培养基中玉米粉含量对解淀粉芽孢杆菌产酶量的影响最大,麸皮含量对解淀粉芽孢杆菌产酶量影响最小,但在α=0.05水平上都不显著,这可能是由于各因素水平间距较小造成的。理论优化组合为A3B1C3D2,即玉米粉4.5%、麸皮2.5%、豆粕4.0%、CaCl20.2%。在该条件下,解淀粉芽孢杆菌Z16的产中性蛋白酶活力为6984.3 U/mL,比产酶条件优化前提高了54.0%(产酶条件优化前为4536.5 U/mL)[9]。

2.2解淀粉芽孢杆菌Z16水酶法提取樟树籽仁油及其工艺条件优化

由表3可知,在相同提取条件下(加酶量10%、酶解时间4 h),解淀粉芽孢杆菌Z16组的樟树籽仁油得率为87.9%,显著高于空白组(75.8%)、枯草芽孢杆菌AS1.398组(阳性对照组)(79.5%),说明解淀粉芽孢杆菌Z16所产酶液耐受中碳链脂肪酸的能力强、对樟树籽仁蛋白有很好的水解作用。解淀粉芽孢杆菌Z16组所得樟树籽仁油的酸价较空白组有所升高,但大幅低于枯草芽孢杆菌AS1.398组(阳性对照组),即相对于空白组,解淀粉芽孢杆菌Z16组所得樟树籽仁油的酸价升高值只有0.3 mg KOH/g,枯草芽孢杆菌AS1.398组(阳性对照组)酸价升高值达16.0 mg KOH/g。可能是因为枯草芽孢杆菌AS1.398所产酶液中脂肪酶活力(实测2.9 U/mL)比解淀粉芽孢杆菌Z16所产酶液中脂肪酶活力(0.088U/mL)高很多[9],致使水酶法提取樟树籽仁油过程中的樟树籽仁油水解率大幅提高,进而大幅提高樟树籽仁油的酸价,降低樟树籽仁油的质量。

表2　正交实验结果Table 2　Rang analysis of orthogonal test for medium

注：*ki为各因素i水平所在实验组对应实验结果的平均值;极差R为各因素ki最大值与最小值之差。

表3　不同菌株的水酶法提取樟树籽仁油结果比较Table 3　Comparison on results of aqueous enzymatic extraction camphor tree seed kernel oil with different strains

注：同一行字母相同为无显著差异,字母不同为显著差异。

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由图5A可知,延长酶解时间可提高樟树籽仁油得率,但酶解4 h后,樟树籽仁油得率几乎不再增加。因此,确定4 h为最适酶解时间,此时樟树籽仁油得率为87.9%。由图5B可知,增加加酶量可提高樟树籽仁油得率,但当加酶量超过20%时,樟树籽仁油得率增加不明显。因此,确定20%为最适加酶量,在该条件下樟树籽仁油得率为91.1%。

图5　解淀粉芽孢杆菌Z16所产酶液的酶解时间 和添加量对樟树籽仁油得率的影响Fig.5　The effects of enzymolysis time and addition enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens Z16 on extraction rate of camphor tree seed kernel oil

3　结论

解淀粉芽孢杆菌Z16的最佳发酵培养基为:玉米粉4.5%,麸皮2.5%,豆粕4%,CaCl20.2%,KH2PO40.03%,Na2HPO4·12H2O 0.4%,pH7.5,121 ℃灭菌20 min;解淀粉芽孢杆菌Z16的最佳发酵条件为:接种量2%,37 ℃、220 r/min,摇瓶培养44 h。在最佳产酶工艺条件下,解淀粉芽孢杆菌Z16所产中性蛋白酶活力为6984.3 U/mL,比产酶条件优化前提高了54.0%。

将解淀粉芽孢杆菌Z16所产酶液应用于水酶法提取樟树籽仁油,可显著提高樟树仁油得率,而所得樟树籽仁油的酸价升高很小。解淀粉芽孢杆菌Z16的水酶法提取樟树籽仁油的效果显著优于国内常用的中性蛋白酶生产菌(AS1.398)的效果,非常适用于水酶法提取樟树籽仁油等中碳链油脂。

解淀粉芽孢杆菌Z16水酶法提取樟树籽仁油的最适酶解时间为4 h、最适加酶量为20%(v/v)。在最佳提取条件下,解淀粉芽孢杆菌Z16水酶法提取樟树籽仁油的樟树籽仁油得率为91.1%。

Culture optimizations and application forBacillusamyloliquefaciensZ16 to produce neutral protease

ZENG Cheng1,MA Mao-mao2,XIAO Yan-jun2,3,*,ZENG Zhe-ling3,4,YU Ping4,ZHONG Wei-min5

(1.School of Medicine,The First Medical College,Nanchang University,Nanchang 330031,China;2.School of Life Science,Nanchang University,Nanchang 330031,China;3.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;4.School of Environmental and Chemical Engineering,Nanchang University,Nanchang 330031,China;5. Fuzhou Vocational Technical College,Fuzhou 344106,China)

The enzyme-producing conditions ofBacillusamyloliquefaciensZ16 and the technological conditions of aqueous enzymatic extraction of camphor tree seed kernel oil were optimized by using single-factor experiment and orthogonal experiment,meanwhile,compared with theBacillussubtilisAS1.398. The best fermentation medium composition ofBacillusamyloliquefaciensZ16 was corn meal 4.5%,wheat bran 2.5%,soya bean meal 4.0%,CaCl20.2%,KH2PO40.03%,Na2HPO4·12H2O 0.4%,pH7.5,and the best fermentation conditions ofBacillusamyloliquefaciensZ16 were inoculation amount 2%,temperature 37 ℃,rate 220 r/min,shake flask culture 44 h. Under the best enzyme-producing technological conditions,the activity of neutral protease produced byBacillusamyloliquefaciensZ16 was 6984.3 U/mL,which was raised by 54.0% after the optimization. The optimum conditions of ofBacillusamyloliquefaciensZ16 aqueous enzymatic extraction of camphor tree seed kernel oil were enzyme adding proportion 20%(v/v),enzymolysis time 4 h. The corresponding camphor tree seed kernel oil yield was 91.1%,and its acid value only rose by 0.3 mg KOH/mL. The effect ofBacillusamyloliquefaciensZ16 on aqueous enzymatic extraction of camphor tree seed kernel oil was obviously superior toBacillussubtilisAS1.398 commonly used to produce neutral protease.

Bacillusamyloliquefaciens;neutral proteinase;camphor tree seed kernel oil;aqueous enzymatic extraction

2015-04-23

曾诚(1993-),男,本科,研究方向：应用微生物学,E-mail:18607080355@163.com。

肖彦骏(1990-),男,硕士,研究方向:应用微生物学,E-mail:thinkreed@126.com。

国家国际科技合作专项项目(2011DFA32770);江西省国际科技合作项目(20112BDH80004,20123BDH80011);南昌市对外科技合作项目(211-DWHZ-SWYY-001);江西省科技支持计划重大项目(20143ACG70015);江西省高等学校科技落地计划项目(KJLD12012);江西省教育厅产学研合作项目(GJJ11003);江西省科技支撑计划项目(GJJ11003)。

TS201.3

B

1002-0306(2016)03-0196-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.033