产天冬氨酸酶菌株大肠杆菌HY05C发酵培养基及培养条件的优化

乔　君,田延军,*,马玉岳,姜国政,赵祥颖,刘建军

(1.山东省食品发酵工程重点实验室,山东济南 250013;2.烟台恒源生物工程有限公司,山东烟台 265709)



乔君1,田延军1,*,马玉岳2,姜国政2,赵祥颖1,刘建军1

(1.山东省食品发酵工程重点实验室,山东济南 250013;2.烟台恒源生物工程有限公司,山东烟台 265709)

为提高大肠杆菌HY-05C在L-天冬氨酸生产过程中的菌体浓度,进而提高单位体积培养液中L-天冬氨酸酶酶活,本文对该菌株的培养基和培养条件进行了优化。首先通过正交实验对大肠杆菌HY-05C培养基组成进行优化,确定了最佳培养基配方(g/L):富马酸铵10,玉米浆干粉8,酵母粉2,蛋白胨7,氯化钠5,磷酸二氢钾1,硫酸镁0.2。又进一步考察了对菌体浓度和酶活影响较大的因素初始pH和接种量,得到了最适pH=6.0,最佳接种量为1.0‰,在上述最佳培养基及培养条件下对大肠杆菌HY-05C的酶转化进程进行测定,优化后培养液的转化效率较初始提高150%,同时也验证了通过发酵条件优化提高单位体积的菌体浓度,提高L-天冬氨酸转化效率方法的可行性。

L-天冬氨酸,大肠杆菌,培养基,培养条件,酶活,优化

L-天冬氨酸(L-Aspartic acid),又名α-氨基丁二酸,分子式C4H7O4N,等电点pI=2.77,略酸,微溶于水,不溶于乙醇或乙醚[1]。L-天冬氨酸是一种常见的酸性氨基酸,在医药、食品、美容、化工、材料等方面具有非常广泛的用途[2-3]。以L-天冬氨酸为原料合成的阿斯巴甜和纽甜,适用于儿童、孕妇、哺乳期妇女以及肥胖、心血管病和糖尿病患者内的所有人群[4-5]。L-天冬氨酸还参与鸟氨酸循环,可用做氨解毒剂、肝机能促进剂、疲劳恢复剂等药品和食品添加剂[6]。L-天冬氨酸的工业化生产始于1974年的日本[7],我国在20世纪80年代后期也进行了工业化生产[8]。L-天冬氨酸的制备主要是利用L-天冬氨酸酶催化氨与富马酸发生加成反应得到,有固定化酶法和游离整体细胞法两种方式,游离整体细胞法与固定化细胞法相比,具有酶活力高,工艺简洁,设备投资少等优势[9],是当今生产L-天冬氨酸的主流工艺。

目前,提高L-天冬氨酸合成效率的方法主要集中在:筛选高产天冬氨酸酶菌株[10-12]、优化天冬氨酸酶转化条件[13-14]和改造天冬氨酸酶[15]等几个方面。归根结底,这些措施都是针对提高L-天冬氨酸酶产生菌的产酶量和提高天冬氨酸酶酶活两个方面展开研究的,而这些优化方法无不具有工作量大、效果不显著、稳定性差等缺点[16]。既然提高L-天冬氨酸酶产生菌的产酶量可以提高天冬氨酸的合成效率,那么若通过发酵条件优化提高单位体积的菌体浓度,则单位体积内的L-天冬氨酸酶总酶活也会随之提高,也就相当于提高了L-天冬氨酸酶产生菌的产酶量。为此,本研究对L-天冬氨酸转化菌的培养基及培养条件进行优化,获得最佳培养基和多级培养方法,并对优化后结果进行生产验证,以期提高单位体积培养液中的L-天冬氨酸酶酶活,提高了后续生产效率和设备利用率。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

大肠杆菌HY-05C(EscherichiacoliHY-05C)烟台恒源生物股份有限公司提供。

高锰酸钾杭州振辉化工有限公司;浓硫酸南京盛庆和化工有限公司;玉米浆干粉山东康源生物科技有限公司;富马酸烟台恒源生物有限公司;氨水武汉制氨厂;酵母粉上海酵母厂;蛋白胨北京双旋微生物培养基制品厂;斜面培养基玉米浆干粉3 g/L;酵母粉3 g/L;蛋白胨1 g/L;氯化钠5 g/L;硫酸锰0.05 g/L,琼脂20 g/L,pH7.0～7.2;发酵培养基富马酸铵10 g/L;玉米浆干粉6 g/L;蛋白胨7 g/L;氯化钠5 g/L;磷酸二氢钾1 g/L;硫酸镁0.2 g/L,将上述原料加适量水溶解,然后用氨水调节pH至7.0～7.2。

XNP-9052BS-Ⅲ生化培养箱上海馨朗电子科技有限公司;XL-YC恒温摇床上海馨朗电子科技有限公司;722型分光光度计上海天普分析仪器有限公司;PY-P10型pH计德国赛多利斯集团;BSA124S-CW电子分析天平德国赛多利斯集团。

1.2转化培养液的制备

取一环活化后斜面菌体接入500 mL(装液量50 mL)摇瓶中,200 r/min,35～37 ℃,培养8 h,得到一级培养液;将一级种子液按1%(v/v)接种量转接到发酵培养基中,200 r/min,培养7 h,得到二级培养液。

1.3实验方法

1.3.1L-天冬氨酸酶酶活测定底物溶液配制:称取富马酸100 g,硫酸镁0.1 g,加入适量蒸馏水搅拌均匀,缓慢加入浓氨水,调节pH7.5后定容至500 mL,既得20%的富马酸铵溶液。

将大肠杆菌培养液加入到20%富马酸铵底物溶液(内含1 mmol/L Mg2+)中,利用高锰酸钾滴定法[13]测定反应体系中富马酸量,计算酶活。

酶活定义:在45 ℃,pH7.5条件下,每小时转化1 μmol富马酸底物的酶量为一个酶活力单位U。

1.3.2细胞浓度测定发酵液稀释10倍,640 nm处测定吸光度值。

1.3.3游离细胞转化进程测定大肠杆菌HY-05C培养液与底物溶液按体积比1∶7混合摇匀,迅速放入45 ℃水浴锅中保温,每小时取样,用高锰酸钾滴定法[13]测定反映体系中富马酸量。

1.3.4统计学分析方法本文正交实验采用正交设计助手V3.1软件通过直观分析对大肠杆菌HY-05C培养基组分进行优化。其他数据采用Origin8.1软件处理得到。

1.4实验方法

1.4.1培养基组分优化方法在原有培养基配方的基础上,对菌株HY-05C培养基进行优化,获得转化培养基。通过前期单因素实验的结果,选取富马酸铵、玉米浆干粉、酵母粉和蛋白胨四个对菌体生长和产酶影响较大的因素进行正交实验优化,设计L9(34)正交实验,以细胞浓度作为评价标准,通过直观分析对培养基组分进行优化,正交实验水平表如表1所示。

表1　大肠杆菌HY-05C碳氮源正交实验水平表Table 1　Orthogonal factors level table of carbon and nitrogen sources by E.Coli HY-05C

1.4.2培养基最适pH优化方法按正交优化后配方(富马酸铵10 g/L,玉米浆干粉8 g/L,酵母粉2 g/L,蛋白胨7 g/L,氯化钠5 g/L,磷酸二氢钾1 g/L,硫酸镁0.2 g/L)配制培养基,用氨水调节培养基的初始pH分别为5.0、6.0、7.0和8.0,118 ℃灭菌20 min,冷却后,取一环活化后斜面接入500 mL(装液量50 mL)摇瓶中,200 r/min,35～37 ℃,培养8 h,测定酶活及菌体量。

1.4.3一级培养液生长曲线的测定按正交优化后配方配制培养基,氨水调节初始pH6.0,118 ℃灭菌20 min,冷却后,接入一环活化后斜面菌种至接入500 mL(装液量50 mL)摇瓶中,200 r/min,35～37 ℃培养,0～10 h,每2 h取样测定酶活及菌体量。

1.4.4二级培养液接种量测定如1.4.3一级培养液培养8 h后,分别按0.5‰、1.0‰、1.5‰、2.0‰、2.5‰(v/v)接种量接入二级培养液,200 r/min,35～37 ℃培养,0～10 h,每2 h取样测定菌体量。

1.4.5二级培养液生长曲线的测定其他条件保持不变(如1.4.4),改变二级培养液的接种量为1.0‰,0～12 h,每2 h取样测定酶活和菌体量。

1.4.6原始和优化后酶转化进程对照将分别以原始和优化后培养基培养的一级培养液15 L,接种到装有15 m3高密度培养培养基的20 m3培养罐中,调整罐压0.08 MPa,通风比0.25,通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧30%,37 ℃培养,每小时取样测定转化液中富马酸浓度。

2　结果与讨论

2.1大肠杆菌HY-05C培养基组分优化

利用正交设计助手V3.1软件设计了4因素3水平的正交实验,共有9个实验点。正交实验直观分析表如表2所示。

表2　大肠杆菌HY-05C碳氮源正交实验直观分析表Table 2　Visual analysis table of carbon and nitrogen sources by E.Coli HY-05C

从表2可以看出,影响大肠杆菌HY-05C生长的原料主次顺序为:玉米浆干粉>蛋白胨>酵母粉>富马酸铵。最佳配方和添加量为(g/L):富马酸铵10,玉米浆干粉8,酵母粉2,蛋白胨7。优化后的培养基酶活及菌体量变化如表3所示。

表3　优化培养基与原始培养基菌体量和酶活对照Table 3　The comparison of biomass and enzyme activity between optimized and original culture medium

从表3可以看出,培养基经优化后菌体量和酶活均相应提高,菌体量提高了约44.83%,酶活提高约51%,优化后菌体量和酶活增长比较明显。确定了通过发酵条件优化提高单位体积的菌体浓度,提高L-天冬氨酸转化效率方法的可行性。

2.2培养基pH对大肠杆菌HY-05C生长及酶活的影响

在培养过程中除原料外,培养基pH同样不容忽视,pH不仅能影响菌体细胞的生长,还与天冬氨酸酶酶活力密切相关。实验结果如图1所示。

图1　培养基pH对大肠杆菌HY-05C生长及酶活的影响Fig.1　Effect of pH on the growth and enzyme activity by E.coli HY-05C

从图1中可以看出,当培养基的初始pH6.0时,培养液的酶活和菌体量最高,此时菌体量和酶活较初始培养液分别提高了51.67%和66.09%。因此,选定培养基的初始pH为6.0。

2.3大肠杆菌HY-05C一级培养液生长曲线的测定

测定大肠杆菌HY-05C一级培养液的生长及酶活进程,以确定二级培养液的最佳转种时间。实验结果如图2所示。

图2　大肠杆菌HY-05C一级培养液生长及酶活曲线Fig.2　The growth and enzyme activity of the first order growth solution

从图2可以看出,菌体生长延滞期较短,2 h即进入对数生长期;8 h几乎达到最高点,菌体处于对数中后期,酶活与菌体量同步增加。经转接实验确定一级种子培养8～10 h转种时间最佳。

2.4大肠杆菌HY-05C二级培养液最佳接种量测定

菌株HY-05C的二级培养采用液体接种,接种量过大,不仅造成资源浪费、增加劳动强度,还会造成菌体生长缓慢等;接种量过小,生长延滞期变长,种子生长缓慢,降低生产效率,增加设备能耗。因此,确定适当的接种量尤为重要。实验结果如图3所示。

图3　大肠杆菌HY-05C二级培养液最佳接种量Fig.3　Inoculation amounts of second order growth solution

从图3可以看出,在整个培养阶段,接种量1‰时,大肠杆菌HY-05C的菌体浓度最高;0～8 h,接种量1.5‰的菌体浓度和1‰基本相同;随着接种量的增加,菌体浓度逐渐降低。因此,菌株HY-05C采用液体接种时,最佳接种量为1‰。

2.5大肠杆菌HY-05C二级培养液生长曲线的测定

测定大肠杆菌HY-05C二级培养液的生长及酶活进程,以确定二级培养液用作转化的最佳培养时间,测定结果如图4所示。

图4　大肠杆菌HY-05C二级培养液的生长曲线Fig.4　The growth and enzyme activity of the second order growth solution

从图4可以看出,由于接种量较低,二级培养液延滞期比一级种子略长,但进入对数期后菌体量增加较快,培养10～12 h基本达到稳定期。菌体培养12 h时,菌体量和酶活较初始培养基分别提高58.33%和105.61%。从数据中可以看出,L-天冬氨酸酶的酶活提高幅度远远大于菌体量的提高幅度,通过分析,这可能是由以下几个方面造成的:随着二级培养液内菌体的生长繁殖,原一级培养液内的菌体细胞衰老自溶,L-天冬氨酸酶释放到培养液中,从而导致OD值提高不大,酶活变化幅度很大;二级培养液接入液体种子后,培养液中菌体在生长过程中形态均一稳定,更多的富马酸能进入细胞内部与天冬氨酸酶发生反应。因此,针对二级培养液中菌体培养过程中的形态变化、转化体系中细胞结构变化、是否转种次数越多越好、又或者其他因素影响、这些问题需要进一步研究探讨,也是以后研究的重点和方向,本文暂不做讨论。

2.6大肠杆菌HY-05C酶转化进程对照

在确定大肠杆菌HY-05C的最佳培养基和培养条件以后,菌株HY-05C在20 m3大罐分别以原始和优化后培养条件进行培养,并对其转化进程进行测定,实验结果如图5所示。

图5　初始培养液和优化后培养液的 游离细胞转化进程对照Fig.5　The transformation efficiency of original and optimizing growth solution

从图5中看出,原始培养液转化天冬氨酸用时约15 h,而优化后的培养液转化天冬氨酸用时仅需6 h,转化效率提高150%。从而验证了通过发酵条件优化提高单位体积的菌体浓度,提高L-天冬氨酸转化效率方法的可行性。大幅提高了生产效率、设备利用率、降低了生产成本。

3　结论与讨论

本研究通过正交实验对大肠杆菌HY-05C培养基进行优化,获得最佳培养基配方为(g/L):富马酸铵10,玉米浆干粉8,酵母粉2,蛋白胨7,氯化钠5,磷酸二氢钾1,硫酸镁0.2,最适pH6.0。与优化前相比,菌株HY-05C的菌体量和天冬氨酸酶活分别提高了44.83%和51%。通过发酵条件优化提高单位体积的菌体浓度,提高L-天冬氨酸转化效率方法的可行性。通过转接实验确定二级种子的最佳接种量为1.0‰,二级培养液的菌体量较原始培养液提高58.33%,酶活较原始培养液提高了105.61%。在上述最佳培养基及培养条件下,对大肠杆菌HY-05C的游离细胞转化进程进行测定,优化后培养液的转化效率提高150%,从而验证了通过发酵条件优化提高单位体积的菌体浓度,提高L-天冬氨酸转化效率方法的可行性。大幅提高了生产效率、设备利用率、降低了生产成本。

实验发现,二级培养液L-天冬氨酸酶的酶活提高幅度远远大于菌体量的提高幅度。这可能是由于二级培养液菌体培养过程中的细胞形态发生了改变;或者是转化体系中细胞结构发生改变;又或者是转种次数多引起的。这些问题值得进一步研究探讨,也是以后研究的重点和方向。

[1]郝大伟,裘娟萍.生物催化富马酸加氨合成天门冬氨酸的研究进展[J].氨基酸和生物资源,2008,30(2):39-43.

[2]金子武夫.アシノ酸工业-合成と利用[J].东京:讲谈社,1973:284-310.

[3]Kang-Man Lee,Ramalingam K,Jong-Keun Son,et al.A Highly Efficient and Large-scale Synthesis of(2S,3S)-[2,3-2H2]-and(2S,3R)-[3-2H]Aspartic Acids Via an Immobilized Aspartase-Containing Microbiol Cell System[J].J Org Chem,1989,54(13):3195-3198.

[4]林应锐.阿斯巴甜的生物合成[J].微生物学通报,1992,19(4):226-229.

[5]胡育骄,刘勇,程池.L-天冬氨酸生产、应用与市场前景[J].食品与发酵工业,2013,19(6):120-124.

[6]郑伟刚.发酵产L-天冬氨酸的初步研究[D]. 南京:南京工业大学,2008.

[7]Tosa TSatoT,Mori T.Immobilization of enzymes and microbial cells using carrageenen as matrix[J].Biotechnol and Bioeng,

1979,43:276-280.

[8]居乃琥,仇昌明,黄国英.用明胶-戊二醛法固定大肠杆菌细胞连续生产L-天冬氨酸[J].工业微生物,1981,11(1):1-9.

[9]Singh R S. A comparative study on cell disruption methods for release of aspartase from E. coli K-12.[J]. Indian Journal of Experimental Biology,2013,51(11):997-1003.

[10]YukawaH,YamadaS,NaraT,et al.Production of L-aspartic acid by reusing cells industrialuse of ethanol utilizing microorganisms[J].Agric Chem Soc Japan,1985,59(1):31-37.

[11]Singh R S,Yadav M. Single-step purification and characterization of recombinant aspartase of Aeromonas media NFB-5.[J]. Applied Biochemistry & Biotechnology,2012,167(5):991-1001.

[12]Kawata Y,Tamura K,Yano S,et al. Purification and Characterization of Thermostable Aspartase from Bacillus sp. YM55-1[J]. Archives of Biochemistry & Biophysics,1999,366(1):40-46.

[13]Depue R H,Ag. M. Factors affecting aspartase activity.[J]. Journal of Bacteriology,1961,82(3):55-63.

[14]Senwo Z N,Tabatabai M A. Aspartase activity in soils:effects of trace elements and relationships to other amidohydrolases[J]. Soil Biology & Biochemistry,1999,31(2):213-219.

[15]Ren H,Xiaojun L I,Yang D,et al. Study on Fusion Expression of Aspartase in E.coli.[J]. Amino Acids & Biotic Resources,.2012,17(5):99-101.

[16]沈明,朱力. 酶法生产L-天冬氨酸之研究[J]. 发酵科技通讯,1997,(4):1-3.

Culture medium and conditions optimization ofL-aspartase-producing strains byEscherichiaColiHY-05C

QIAO Jun1,TIAN Yan-jun1,*,MA Yu-yue2,JIANG Guo-zheng2,ZHAO Xiang-ying1,LIU Jian-jun1

(1.Food & Fermentation Engineering Key Lab of Shandong Province,Jinan 250013,China;2.Yantai Hengyuan Bio-Engineering Co.,Ltd,Yantai 265709,China)

In order to improve the cell concentrations andL-aspartase activity durting theL-asparate production ofEscherichiacoliHY-05C,the culture medium and culture conditions were optimized. First of all,the orthogonal experiment was employed to optimize the medium compositions and the optimal fermentation medium was obtained(g/L):ammonium fumarate 10,corn steep liquor powder 8,yeast powder 2,peptone 7,NaCl 5,KH2PO41,MgSO40.2. Furthermore,the initial pH and inoculum size which had significant influence on bacteria concentration and enzyme activity were investigated,and the optimal pH and inoculum size were determined as 6.0 and 1‰,respectively. Finally,the enzymatic conversion process ofE.coliHY-05C was confirmed using the optimal medium and the culture conditions. Compared with the initial cultual conditons,its conversion efficiency was improved by 150%. Also,it verified the feasibility that the increasing cell concentrations via the optimization of fermentation conditions could enhance the conversion efficiency ofL-asparatase inE.coliHY-05C.

L-aspartic Acid;Escherichiacoli;culture medium;culture condition;enzyme activity;optimization

2015-07-15

乔君(1985-)，男，硕士研究生，中级工程师，研究方向：生物发酵，E-mail：qj851217@126.com。

田延军(1970-)，男，博士研究生，研究员，研究方向：生物发酵，E-mail:tianyanjun16@163.com。

山东省自主创新专项(2013CXC20601)；山东省泰山学者岗位建设工程经费资助(ts20130919)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)03-0139-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.021