金丝小枣低聚糖的制备及其体外活性研究

尹硕慧,赵莹彤,罗　欢,布　蕾,马　珺,任迪峰,*,鲁　军

(1.北京林业大学生物科学与技术学院食品系、林业食品加工与安全北京市重点实验室,北京 100083) (2.中国食品发酵工业研究院、北京市蛋白功能肽工程技术研究中心,北京 100015)



金丝小枣低聚糖的制备及其体外活性研究

尹硕慧1,2,赵莹彤1,罗欢1,布蕾1,马珺1,任迪峰1,*,鲁军2,*

(1.北京林业大学生物科学与技术学院食品系、林业食品加工与安全北京市重点实验室,北京 100083) (2.中国食品发酵工业研究院、北京市蛋白功能肽工程技术研究中心,北京 100015)

为探索金丝小枣低聚糖提取工艺及其生物活性,开发利用金丝小枣的营养功能价值,本文以酸解结合酶解的方法对金丝小枣多糖进行降解,利用正交法优化制备工艺。以3-氨基-9-乙基咔唑作为衍生剂对所制备的低聚糖进行HPLC柱前衍生,分析其单糖组成,并对其抑制食物腐败菌的活性及抗氧化性进行体外实验研究。结果表明,以0.5 mol/L的三氟乙酸,80 ℃水解小枣多糖6 h;对所得沉淀以0.05 mg/mL果胶酶在45 ℃下酶解40 min,可较高效率获得金丝小枣低聚糖,其得率为:24.87%±0.63%。单糖组分分析最佳色谱条件为:流动相28∶52,乙腈-水(0.1 mol/L醋酸铵缓冲液,pH4.3);流速0.8 mL/min;UV 254 nm。所制备的小枣低聚糖经测定具有抑菌活性,对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为0.195、0.781、0.391 mg/mL,且具有一定的抗氧化能力,在其浓度为25 mg/mL时,总抗氧化能力为(4.69±0.14) U,DPPH·清除率为57.71%±0.51%,·OH清除率为35.24%±1.08%。说明金丝小枣具有功能营养开发利用的价值。

金丝小枣低聚糖,生物活性,抑菌,抗氧化

低聚糖(oligosaccharides)大多具有一定的生物活性与营养价值,在促进动植物生长、抑菌、抗癌等方面有重要作用[1-3],通常以天然植物多糖进行降解得到。目前,国内外有关植物多糖制备低聚糖的研究多采用苹果、柑橘、橘皮等为原料进行果胶多糖的提取以及低聚糖的制备[4-7]。

金丝小枣,是我国栽培面积和产量最大的枣品种之一,与其他品种相比有较高的含糖量和较长的贮藏期,但是可食率和风味较低[8],孙曙光等[9]研究金丝小枣浓缩汁发现其多糖含量达95%以上,且灰分以及蛋白质含量较低,适合作为多糖的提取原料。赵智慧等[10-11]对金丝小枣水溶性多糖进行了研究,发现小枣多糖中含有大量的半乳糖醛酸,认为金丝小枣多糖的主要类型为果胶多糖。然而,目前对于枣类多糖制备低聚糖的研究较少,一般采取从枣中直接提取的方法[12-13],同时缺乏对小枣低聚糖组成的分析。Fanaro[14]等发现果胶多糖降解制备产物对肠道菌群有一定的益处;王向红[13]等发现金丝小枣低聚糖具有对双歧杆菌的体外促生长功能。然而,金丝小枣低聚糖的其他生物活性还有待研究。

低聚糖的降解制备方法主要有化学法和酶解法两种[15-16]。但是,酸解法不易控制反应进程,且产物不适宜直接在食品领域应用;而酶解法条件温和,不能达到很好的降解效果[17]。因此,本实验以金丝小枣为材料,利用酸解法与酶解法相结合,辅以超声波处理和超滤,降解制备金丝小枣低聚糖。同时,利用柱前衍生法分析其单糖组成,并对其抑制食物腐败菌的活性以及抗氧化进行体外实验研究,为金丝小枣资源的深度开发提供理论依据,有利于拓宽枣类多糖的研究。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

金丝小枣由沧州宏伟食品有限公司提供;果胶酶(酶活>40 U/mg)宁夏和氏璧生物技术有限公司;大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubltillus)由北京林业大学生物科学与技术学院生物系微生物实验室提供;半乳糖(Gal)、鼠李糖(Rha),LANYI试剂公司;阿拉伯糖(Ara)Sigma公司;半乳糖醛酸(GalA),Fluka公司;木糖(Xyl)北京奥博星生物技术有限责任公司;葡萄糖(Glc)、醋酸铵缓冲液西陇化工股份有限公司;三氯乙酸(TFA)北京市兴津化工厂;3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、NaBH3CN日本;总抗氧化能力检测试剂盒(T-AOC)南京建成生物工程研究所;甲醇溶液、乙腈国产色谱纯;其他试剂为国产分析纯。

高速万能粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司;KQ3200DE型数控超声波粉清洗器昆山市超声仪器有限公司;台式高速离心机 H/T16MM湖南赫西仪器装备有限公司;DZF真空干燥箱上海龙跃仪器设备有限公司;DHJ-9033B5-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱上海新苗医疗器械制造有限公司;FD-1冷冻干燥机北京德天佑科技发展有限公司;SPD-M20A高效液相色谱仪岛津公司;立式压力蒸汽灭菌锅上海博讯实业有限公司医疗设备厂;722型可见分光光度计上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1金丝小枣多糖的提取将金丝小枣去核后烘干,粉碎备用。取500 g枣粉,优化李进伟[18]的实验条件,提取金丝小枣多糖,即采用超声波法,以蒸馏水溶解枣粉,料液比1∶20(v/v),提取功率90 W,时间20 min,得金丝小枣粗多糖溶液。溶液离心,取上清液,减压浓缩,调含醇量至80%,静置过夜,取沉淀。依次用无水乙醇、丙酮洗脱并离心,取上清液过聚酰胺柱进行脱色,对流出液再次调含醇量至80%,静置过夜,取沉淀,冷冻干燥后得金丝小枣精多糖。

1.2.2金丝小枣低聚糖的制备称取0.2 g小枣精多糖,用4 mL TFA溶液对多糖进行酸水解,调节各个水解条件,反应条件及因素水平见表1。一定时间后将溶液于6000 r/min离心10 min,取沉淀。并根据王丹波[19]关于温度对果胶酶水解反应影响的研究结果,选择在45 ℃的水浴条件下,用不同浓度(0.025、0.05、0.075 mg/mL)的果胶酶解液进行酶解,分别于40、60、80 min时取样,利用咔唑比色法[20]测定产物吸光度值。配制标准半乳糖醛酸溶液,制定标准曲线,并以产物吸光度值对比所作标准曲线计算出在不同水解条件下所得小枣低聚糖的含量。根据最优条件下所得金丝小枣低聚糖的浓度,计算其得率,公式如下:

金丝小枣低聚糖得率(%)

表1　因素水平表Table 1　Factors level of orthogonal test

1.2.3金丝小枣低聚糖成分分析等摩尔配制0.1 mol/L的混合标准单糖溶液(半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖)作为标样,根据孙静[17]通过AEC-HPLC柱前衍生化对金丝小枣低聚糖的单糖组成进行分析,用具有紫外吸收的衍生化试剂(AEC)与糖类物质反应,使糖类物质带上紫外吸收基团,通过HPLC的紫外检测器进行检测,对比标准样品色谱图进行分析。同时进行色谱条件的优化:保持pH4.3,流速0.8 mL/min,柱温 25 ℃不变,改变流动相乙睛含量,结合不同UV值的图谱分离情况,确定乙腈与醋酸铵缓冲液的最佳配比。

1.2.4金丝小枣低聚糖的抑菌作用研究以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌为对象菌,制备各供试菌的菌悬液。配制500 mL牛肉膏蛋白胨培养基,将各供试菌种经斜面培养基活化,分别用无菌水配制成每毫升含菌数为106～108个的菌悬液。

表3　方差分析表Table 3　Variance analysis of orthogonal test

注:*:在0.05水平下差异显著。

采用打洞法[21],实验重复3次,选取抑菌圈直径的平均值,通过判断抑菌圈大小判定小枣低聚糖的抑菌活性。采用二倍稀释法[22]测定样品对于各实验菌种的MIC值,在波长为600 nm测定其吸光度值。平行进行三组实验,选取平均值。

1.2.5金丝小枣低聚糖体外抗氧化实验取最佳降解条件下所得样品,配制成不同浓度(5、10、15、20、25 mg/mL)的寡糖溶液,采用还原法测定小枣低聚糖的总抗氧化能力[23]。选用南京建成生物工程研究所生产的总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒进行实验。按周忠波等[24]的方法测定·OH清除率,即依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4和水杨酸-乙醇溶液,1 mL 甲醇溶液及1 mL 8. 8 mmol/L H2O2,在37 ℃水浴加热30 min,以甲醇作参比,在510 nm下测定其吸光度A0。以1 mL的5、10、15、20、25 mg/mL样品溶液,替换甲醇溶液,测定510 nm处吸光度AX。将8.8 mmol/L H2O2换为甲醇溶液,测定其吸光值AX0。实验重复3次。按李永裕等[25]的方法测定小枣低聚糖DPPH·清除率,分别吸取1 mL 的5、10、15、20、25 mg/mL样品溶液,各加入1 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液,摇匀,避光暗处放置30 min。以无水乙醇作为空白对照,在517nm波长处测定吸光度Al。同时,测定1 mL无水乙醇和1 mL DPPH混合液的吸光度A0。实验重复3次。

2　结果与分析

2.1金丝小枣低聚糖制备的最佳条件

2.1.1金丝小枣多糖的酸水解工艺优化枣粉按1.2.1节提取方案浸提,经除杂、醇沉后得金丝小枣精多糖。根据预实验结果,按1.2.2所述,选用TFA溶液浓度、酸解温度、酸解时间为主要考察因素,利用正交实验设计对金丝小枣多糖的TFA溶液酸解工艺条件进行探究,以确定最佳酸解条件。不同条件下样品处理结果如表2所示,方差分析结果见表3。

表2　L9(33)正交实验设计及结果表Table 2　Orthogonal array design arrangement and the experimental data

由表2可以看出,对极差R进行分析,三个变量因素RC>RB>RA,因素C(酸解时间)的极差R为0.0330最大,是主要影响因素。根据K值进行分析,得出TFA溶液酸解金丝小枣多糖的最佳工艺条件为C3B2A2,即TFA溶液浓度0.5 mol/L,酸解温度80 ℃,酸解时间6 h,此条件进行酸解实验产物质量为0.0988 g。对表3进行方差分析,发现酸解时间对于酸解产物质量的影响在显著性水平0.05上显著,而TFA溶液浓度、酸解温度对酸解产物质量的影响不显著。

2.1.2金丝小枣多糖酸水解后所得沉淀的酶解工艺优化配制标准半乳糖醛酸溶液,制定标准曲线如图1。以最佳条件酸解后的产物为原料,用果胶酶于45 ℃水浴条件下进行酶解。选用酶浓度、酶解时间为探究因素,利用咔唑比色法测定产物吸光度值,对金丝小枣多糖酸水解后所得沉淀的酶解工艺条件进行探究,实验结果见表4。

图1　半乳糖醛酸标准曲线Fig.1　The standard line of Galacturonic acid表4　酶解优化实验设计及结果表Table 4　Orthogonal array design arrangement and the experimental data

实验号酶液浓度(mg/mL)反应时间(min)产物浓度(mg/mL)10.0254016.4320.025606.7630.025806.9640.054016.5750.05607.3260.058014.0770.075409.5980.075606.9090.0758010.96

实验结果表明,酶解液浓度为0.05 mg/mL,且反应40 min时产物浓度最高,为16.57 mg/mL。即果胶酶酶解金丝小枣酸解产物的最佳条件为:酶液浓度0.05 mg/mL,水浴反应温度45 ℃,反应时间40 min。经重复实验,得小枣低聚糖得率为:24.87%±0.63%。

表5　不同浓度金丝小枣低聚糖处理实验菌的OD600值Table 5　OD600 values of lab strains dealt with different concentrations of ZizyphusJujuba cv. Jinsixiaozao oligosaccharides

2.2金丝小枣低聚糖HPLC柱前衍生化法分析

经研究,乙腈与醋酸铵缓冲液的最佳配比为28∶52。取衍生化好的标品及样品进行HPLC分析,色谱条件为:流动相,28∶52的乙睛-水(0.1 mol/L的醋酸铵缓冲液,pH4.3);流速 0.8 mL/min;柱温 25 ℃;UV 254 nm。实验结果见图2。

图2　6种单糖标准品 以及金丝小枣低聚糖的AEC-HPLC图谱Fig.2　AEC-HPLC maps of the six monosaccharide standards and the ZizyphusJujuba cv. Jinsixiaozao oligosaccharides注:1.GalA,2.Gal,3.Glc,4.Ara,5.Xyl,6.Rha。

由图2可以得出,制备所得的金丝小枣低聚糖的主要单糖成分有半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖6种,其相对百分含量比值为52.07∶9.27∶6.22∶18.28∶8.40∶5.76。

2.3金丝小枣低聚糖的抑菌作用实验结果与分析

根据1.3.4的方法进行实验,以无菌水为对照,通过观察抑菌圈的大小来判断金丝小枣低聚糖对于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及金黄色葡萄球菌3种供试菌的抑菌效果。抑菌圈大,则金丝小枣低聚糖对该菌种的抑菌效果好。实验结果见图3。

图3　金丝小枣低聚糖的抑菌实验结果Fig.3　Antibacterial activity of ZizyphusJujuba cv. Jinsixiaozao oligosaccharid

最小抑菌浓度的测定结果均值如表5。通过计算,选择p<0.05时的OD值所对应的金丝小枣低聚糖浓度,为金丝小枣低聚糖对该菌的最低抑菌浓度。

从图3可以看出,金丝小枣低聚糖对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌,皆有一定的抑菌作用,抑菌圈直径分别为11.90±0.32、10.93±0.12、(9.97±0.12)mm。金丝小枣低聚糖对于细菌的抑制活性为大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌。

由表5并结合计算可以得出,金丝小枣低聚糖在浓度等于0.195、0.391、0.781 mg/mL时对应大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的OD值,在t检验下的p值依次为0.017、0.027、0.016。且金丝小枣低聚糖浓度大于上述值时,对应实验菌的OD值在t检验下均显著(p<0.05)。因此金丝小枣低聚糖对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度(MIC)依次为0.195、0.391、0.781 mg/mL,其中大肠杆菌的MIC值最小,抑制效果最好。

2.4金丝小枣低聚糖的抗氧化实验结果与分析

抗氧化剂清除自由基是由于自身的还原作用给出电子[26],其还原力(总抗氧化力)强则抗氧化能力强,因此总抗氧化力强弱可以反映抗氧化活性的大小。样品的总抗氧化能力(U)曲线如图4a。

DPPH·是一种稳定存在的有机自由基,由于可以快速、灵敏、稳定的测定,广泛用于物质抗氧化性的评价[27],此外清除·OH也是常用的评价抗氧化能力的方法之一。样品的自由基清除率作用曲线如图4b。

图4　金丝小枣低聚糖的氧化能力测定Fig.4　The anti-oxidative effect of ZizyphusJujubacv. Jinsixiaozao oligosaccharides

结果显示,金丝小枣低聚糖具有明显的总抗氧化能力以及DPPH·、·OH清除能力,氧化效果随着其浓度的增加呈现上升趋势,且相比之下对于DPPH·的清除能力强于·OH。在金丝小枣低聚糖浓度为25 mg/mL时,其总抗氧化能力为(4.69±0.14)U,DPPH·清除率为57.71±0.51%,·OH清除率为35.24%±1.08%。因此,金丝小枣低聚糖具有一定的抗氧化能力,且随浓度升高,抗氧化能力增强。

3　结论

采用酸解结合酶解的方法制备金丝小枣低聚糖,其最佳降解条件为:0.5 mol/L的TFA溶液80 ℃水解小枣多糖6 h;对所得沉淀再以0.05 mg/mL的酶解液,45 ℃酶解40 min。小枣低聚糖的得率为:24.87%±0.63%。

HPLC对金丝小枣低聚糖样品进行成分分析的最佳色谱条件:流动相为28∶52,乙腈-水(0.1 mol/L的醋酸铵缓冲液,pH4.3);流速0.8 mL/min;UV 254 nm。液相色谱分析结果表明:金丝小枣低聚糖组成为半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖,其相对百分含量比为52.07∶9.27∶6.22∶18.28∶8.40∶5.76。

金丝小枣低聚糖对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌,皆有一定的抑菌作用,抑菌圈直径分别为11.90±0.32、10.93±0.12、(9.97±0.12) mm,抑制活性为大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌,最小抑菌浓度依次为0.195、0.391、0.781 mg/mL。

金丝小枣低聚糖具有总抗氧化能力以及对DPPH·、·OH的清除能力,且抗氧化性能随着浓度升高增强。在金丝小枣低聚糖浓度为25 mg/mL时,其总抗氧化能力为(4.69±0.14)U,DPPH·清除率为57.71%±0.51%,·OH清除率为35.24%±1.08%。

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Preparation and bioactivitiesinvitroof oligosaccharides fromZizyphusJujubacv.Jinsixiaozao

YIN Shuo-hui1,2,ZHAO Ying-tong1, LUO Huan1,BU Lei1,MA Jun1,REN Di-feng1,*,LU Jun2,*

(1.Beijing Key Laboratory of Forestry Food Processing and Safety,College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China；2.Beijing Engineering Research Center of Protein & Functional Peptides,China National Research Institute of Food & Fermentation Industries,Beijing 100015,China)

To explore the extraction process and bioactivities of oligosaccharides fromZizyphusJujubacv.Jinsixiaozaoas well as utilization of its nutrition value,the methods of acidolysis and enzymolysis were employed to degrade polysaccharides inJinsixiaozao,and the preparation process was optimized orthogonally. The composition of monosaccharide was analyzed by high performance liquid chromatography after precolumn derivation of oligosaccharides using 3-amino-9-ethylcarbazole as the derivating agent.Invitroassays were also conducted to investigate the antioxidant activity and inhibitory effects on food spoilage bacteria.Jinsixiaozaooligosaccharides were prepared efficiently by using 0.5 mol/L trifluoroaceticacid(TFA)to hydrolyzeJinsixiaozaopolysaccharideat 80 ℃ for 6 h,following by enzymatic hydrolysis of the resulting precipitation at 45 ℃ for 40 min by 0.05 mol/L pextaseon,and its yield was 24.87%±0.63%. The chromatographic conditions for analyzing of the monosaccharide composition were mobile phase,acetonitrile-water 28∶52(0.1mol/L ammonium acetate buffer,pH4.3),flow velocity,0.8 mL/min,detection wavelength,254 nm. The results indicated that theJinsixiaozaooligosaccharide extraction possessed inhibitory activities on bacteria,with minimal inhibitory concentrations oncolibacillus,bacillussubtilisandS.aureusat0.195,0.781,0.391 mg/mL respectively. The extract also had a certain antioxidant capacity,of which the total antioxidant capacity was(4.69±0.14)U,the DPPH· scavenging rate was 57.71%±0.51%,and the OH· scavenging rate was 35.24%±1.08% at a concentration of 25 mg/mL,respectively. All of these indicated thatJinsixiaozaohad a value for development and utilization of its health-care functions.

ZizyphusJujubacv.Jinsixiaozao;oligosaccharide;bioactivity;bacteriostasis;antioxidation

2015-07-13

尹硕慧(1994-)，女，本科，研究方向：食品科学,E-mail：bestwishyinsh@126.com。

任迪峰(1973-)，女，博士，教授,研究方向：食品营养与生物技术,E-mail：rendifeng@bjfu.edu.cn。

鲁军(1973-)，男，博士，高级工程师，研究方向：功能性食品, E-mail：johnljsmith@163.com。

国家林业公益性行业科研专项资金(201304805)；国家自然科学基金项目(31201339、31571772)；北京市大学生科学研究与创业行动计划项目(S201410022039)；国家“863”计划项目(2013AA102205)；“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD33B04)；北京市科技北京百名领军人才培养工程项(Z131110000513026)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)03-0063-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.004