食源性致病菌快速检测的前增菌培养的研究进展

钱红玫,胡文忠,冯　可,萨仁高娃,邵文俊

(1.大连工业大学食品学院,辽宁大连 116600;2.大连民族大学生命科学学院,辽宁大连 116600;3.大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116024)



食源性致病菌快速检测的前增菌培养的研究进展

钱红玫1,胡文忠2,*,冯可3,萨仁高娃3,邵文俊2

(1.大连工业大学食品学院,辽宁大连 116600;2.大连民族大学生命科学学院,辽宁大连 116600;3.大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116024)

近年来,由食源性致病菌污染食物导致中毒或死亡事件在全球频发,严重危害人类健康,食源性微生物引起的疾病已成为危害人类健康的头号杀手。目前,食源性致病菌快速检测技术研究已成为国际学者关注的热点,研究的焦点主要集中在快速检测技术。但是,在快速检测中,尤其是分子生物学检测技术需要增菌过程,如何缩短前增菌时间和提高增菌效果,是快速检测研发解决的难题。本文对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌和志贺氏菌的爆发案例进行了简述,重点综述了前四种菌的前增菌的研究现状,以便了解到现有的快速检测的前增菌培养的研究情况,在更短时间检测出食源性致病菌。

食源性致病菌,增菌培养,快速检测

食源性致病,是食品安全性问题重要的关注点,也是食品安全研究的一个重要方向。据统计,世界因食品污染而致病的人数已达数亿人,其中由生物性污染造成的人数占首位[1],是一个十分严重的安全问题。近几年来,随着科技的发展,工业食品也随之增加,伴随着对工业食品的大量食用,食源性致病菌污染食品而引起的中毒爆发事件在全球时有发生,据统计,40%的中毒爆发事件是因为餐馆或生产机构生产时食物被污染[2]。食源性感染往往会大量的感染人群,会在学校,工厂、餐厅等许多机构迅速的发生,病原体的快速检测和鉴定是控制食源性疾病爆发的关键问题[3]。面对如此大的致病率,食源性致病菌的快速检测问题也得到了普遍的关注。在致病微生物中,沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7、副溶血性弧菌等几种菌是常见的因污染果蔬、肉类、海产品而引发致病的菌种。目前,利用传统的检测方法检测食源性致病菌仍存在着检测时间长、操作方法复杂、检验结果不准确等问题,因此,如何能快速增菌,是实现快速检测的前提。虽然现有的分子生物学检测技术已经相对成熟,但将前增菌与检测技术相结合的研究仍然是一个盲点,有待进一步的改进。本文对近几年食源性致病菌的爆发情况和现有的前增菌培养的研究进展进行了综述,以期对未来的快速检测研究有一定的参考价值。

1　常见的食源性致病菌的爆发

食源性致病菌一直是食品安全问题的一个隐患,在全球,每年都会有大量的人群被食源性致病菌威胁到生命安全,表1对近几年来几种常见的食源性致病菌的爆发案例进行了列举。

表1　几种常见的食源性致病菌的爆发案例

从上表1可以看出,近3年来,在世界各地,因餐厅或工厂的卫生问题而导致食物被食源性致病菌感染,进而引发的食源性疾病的爆发情况仍然存在,其爆发情况一般是小面积大量爆发,因没有及时的应对措施,常常会引起人群的恐慌,并让大家对食品安全性问题产生质疑。面对如此严峻的形势,食源性致病菌快速检测的问题也随之变得尤为重要。

2　食源性致病菌单菌的增菌培养的研究

2.1沙门氏菌前增菌培养的研究

虽然分子生物学方法[14]和免疫学方法[15]能快速检测沙门氏菌污染样品的状况,但通过前增菌培养使菌体达到检测量也十分的重要。根据沙门氏菌的国家检测标准[16],沙门氏菌的检出时间大约在3～4 d,时间十分漫长。索标[17]等人结合荧光PCR检测技术,对热损伤沙门氏菌检测前的选择性增菌进行了研究,其对已有的SEL培养基进行了优化,向其中添加了0.01 g/L的吖啶黄、0.05 g/L的环己酰亚胺、0.05 g/L的磷霉素以及0.002 g/L的萘啶酸,最终得到的培养基作为损伤沙门氏菌的修复剂以达到增菌的效果。实验结果表明,SEL可以在20 h内可以使各种接种量的菌体修复至109CUF/mL。郭闯[18]等人也结合了PCR技术对快速检测的前增菌进行了研究,其选用了氯化镁孔雀绿增菌液(MM)和缓冲蛋白胨水(BPW)两种增菌液进行了研究,并将两种增菌液的增菌效果进行了比较,研究结果表明,短时间内,BPW的增菌效果明显优于MM,增菌24 h后两种增菌液的增菌效果基本相同;对BPW不同增菌时间的增菌效果进行比较,发现8 h的增菌效果是最佳效果。范媛媛[19]等人对一种新推出的SX2液体培养基进行了验证,SX2液体培养是应用于前增菌的一种新型培养基,这种培养基可以省去划平板和观察菌落特征的时间,且得出结果准确,是实验室快速检测沙门氏菌的一种选择。

2.2金黄色葡萄球菌前增菌培养的研究

金黄色葡萄球菌广泛存在于自然界中,到目前为止,已经发现了20种以上的金黄色葡萄球菌和类似金黄色葡萄球菌[20]。我国每年由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居第4位[21]。由于金黄色葡萄球菌对人体健康有重大影响,各国均将该菌作为食品重点检测和监控的项目。目前我国的检测方法主要是按照国家标准GB4789.10-2010[21]进行的,其检出时间一般在36～72 h。为了找出一种更快捷的增菌方法用以检验,李晓琍[22]等人对2种增菌液的增菌效果进行了研究。其利用菌体在Baird-Parker琼脂平板上的生长情况来比较验证2种增菌培养基的增菌效果。实验结果表明,在金黄色葡萄球菌含量比较高时,采用7.5%氯化钠肉汤增菌,只需要6 h就可以使菌体浓度从100CUF/mL增加至105CUF/mL;而对于金黄色葡萄球菌含量比较低而杂菌含量高的情况,则采用10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的增菌效果更好,但在培养24 h后才能达到增菌的效果。为了更快的检测出金黄色葡萄球菌,李莹[22]以营养琼脂为基础,通过添加促进金黄色葡萄球菌生长的添加剂,最终得到配方:蛋白胨10 g/L、酵母粉5.0 g/L、丙酮酸钠5.0 g/L、氯化钠20 g/L、亚碲酸钾20 mg/L、氯化锂5 g/L、琼脂15 g/L、5-溴·4-氯-3-吲哚基磷酸酯0.3 g/L。经过实验验证,与传统的Baird-Parker琼脂平板相比,其在18 h就可以检出菌体,与传统方法相比,大大缩短了时间,检出率达到(90.2±6.7)%,检测结果与国标无明显差异,证明了其有效性。张超楠[23]将计算机视觉技术与前增菌技术结合,通过对促进剂和抑制剂的选择,得到配方:胰蛋白胨17.0 g/L,植物蛋白胨3.0 g/L,氯化钠68 g/L,磷酸氢二钾2.5 g/L,葡萄糖2.5 g/L,丙酮酸钠5 g/L,甘氨酸9 g/L,亚碲酸钾60 mg/L,苯乙醇3.8 mL/L。此增菌培养基在4 h内可以抑制除金黄色葡萄球菌外的生长,并可以达到增菌的效果,其在10～107CFU/mL(g)的菌落数范围内都可以检出,与传统方法相比,不仅节省了时间,并且可以准确的检出。

2.3单增李斯特菌前增菌培养的研究

该病原菌广泛分布于自然界,有较强的生存能力,但一般情况下,食品中单增李斯特菌含量较低,且往往在加工中受到损伤[26-28]。因此,分离单增李斯特菌之前,必须对待检样品进行增菌。目前我国的检测方法主要是按照国家标准GB4789.30-2010[29]进行的,其检出时间一般在4～6 d。近几年来,很多研究人员对单增李斯特菌的增菌进行了研究,其中朱敏[30]等人就做了有关于改良李斯特菌增菌液的研究。因李斯特菌的显色培养基增菌效果没有那么明显,故向其中加入增菌剂和抑菌剂,将不同浓度的吖啶黄、萘啶酮酸、亚碲酸钾、氯霉素加入增菌液中,发现用吖啶黄15 mg/L、萘啶酮酸20 mg/L、亚碲酸钾15 mg/L的李斯特菌改良增菌液增菌,单增李斯特菌检出率明显高于国标法(p<0.05),单增李斯特菌的检出率明显提高了很多。傅宜方[31]等人提出了一种“前增菌方法”,即对损伤的李斯特菌进行修复以使菌体数量达到更多,使检出效果更明显,在用此方法增菌4 h后,与传统方法比较,其检出率为8.04%,远远大于传统方法的检出率1.79%,是前增菌的一个有利选择。

2.4副溶血性弧菌前增菌培养的研究

副溶血性弧菌(VP)每年导致大约35000人患有食源性疾病[32],因该菌是一种在海洋中或盐湖中广泛生长的嗜盐菌,所以其一般浸染的海产品居多[33]。目前我国的检测方法主要是按照国家标准GB4789.7-2010[34]进行的,其检出时间一般在44～66 h。为了提高副溶血性弧菌的检出率,检测前的前增菌是必不可少的,现有的培养基增菌时间过慢,因此,许多人对优化培养基进行了研究。赵广英[35]等人根据副溶血性弧菌的培养生长条件以混合型蛋白胨和酵母浸膏为基础培养基,向其中添加有益于副溶血性弧菌增长的试剂,通过正交实验得到配方:混合蛋白胨2%(胰蛋白胨1%、鱼蛋白胨1%)、酵母浸膏0.2%、氯化钠3.5%,当用这种配方并调节pH至8.6时,其对副溶血性弧菌增菌效果是普通增菌液的(1.4±0.5)倍,由此可见,其增菌效果明显提高,可以提前达到检出限并可以提高检出率。陈冠武[36]等人也对海水中的副溶血性弧菌的培养基进行了优化,其通过将不同的副溶血性弧菌培养基组合或将其中一种弧菌培养基与碱性蛋白胨水相组合,并与常用于检测弧菌的TCBS琼脂和弧菌显色培养基进行比较,实验结果表明,碱性蛋白胨水与3%氯化钠碱性蛋白胨水组合后增菌5～6 h后,其对副溶血性弧菌的分离效果和检出效果都有明显的提高。刘雪飞[37]等人利用响应面法优化了副溶血性弧菌的培养基,最佳的配方:酪蛋白胨6.75 g/L、胰蛋白胨3.25 g/L、牛肉膏4.76 g/L、氯化钠36.75 g/L。用此配方通过响应面法进行检测,当培养12 h后,其检测结果是模型预测值的98.77%,可以充分的检测出副溶血性弧菌,是一个可靠地结果。

3　食源性致病菌共增菌培养的研究

食源性疾病暴发时,引发暴发的致病菌并不明确,如果只对单一的菌种进行增菌然后逐个检测,十分的浪费人力与财力,因此,对于可以同时富集多种致病菌培养基的研究变得更加重要了。就目前而言,共增菌培养的研究相对较少,现最多只有三种菌的富集。常用的方法为向液体培养基中加入增菌剂和抑菌剂,通常向培养基中所添加的增菌剂与抑菌剂[38-39]有亚碲酸钾、氯化锂、甘露醇、丙酮酸钠、吖啶黄、萘啶酮酸、柠檬酸钠、水杨酸、苯乙醇、磷霉素等。

王永志[40]等人研制出了一种可以使沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌共增菌的培养基,其以15 g/L胰蛋白胨、5 g/L大豆蛋白胨、2.5 g/L磷酸二氢钾、2.5 g/L葡萄糖、35 g/L氯化钠为基础增菌培养基,向其中加入增菌集和抑菌剂:氯化锂0.5 g/L、牛胆盐0.1 g/L、甘露醇2 g/L、亚碲酸钾0.3 mg/L,最终得到的培养基可以充分满足三种菌共同生长,增菌12 h就可以使菌从103CFU/mL增加至107CFU/mL,能够充分达到检测限。翁思聪[41]等人研制出了一种SSSV共增菌培养基,其可以使沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌同时生长,其以BPW为基础培养基,向其中加入促进目标菌生长,抑制其他菌的添加剂,最终得到配方:缓冲蛋白胨水20 g/L、鱼蛋白胨12 g/L、胆盐3号3 g/L、柠檬酸钠1.5 g/L、氯化锂1 g/L、亚碲酸钾1.2 mg/L、氯化钠15 g/L、葡萄糖2 g/L、甘露醇1 g/L、丙酮酸钠4 g/L。将此配方调节pH至7.2±0.4进行验证,结果表明,利用SSSV培养三种菌8 h后,菌体浓度可达到106CFU/mL,不仅增菌时间短,增菌效果也十分明显。陈萍[42]等人对沙门菌、志贺菌和金葡菌共增菌的培养基也进行了研制,其利用PCR对增菌效果进行鉴定,结果显示,增菌培养基在增菌4 h即可达到PCR的检测限,接种100 CFU/mL的菌液,在培养12 h后,可增加至106～108CFU/mL的菌量,充分达到了增菌的效果。王虎虎[43]等人提出了一种新的增菌方法,3种菌共修复,其利用TSB-YE作为修复亚致死状态的致病菌,且得到了较好的增菌效果。

经过这几种培养基的比较,得出结果表明,大多数增菌培养基的研究都是以现有的培养基为基础培养基,通过添加对菌体有促进作用的试剂,并抑制其他菌体的生长,得到一种全新的共增菌培养基,此培养基的研制可以同时富集多种致病菌,最终达到可以同时检出的效果,节省检出时间。

4　展望

目前,食品安全问题一直是各国关注的焦点,而食源性致病菌的致病问题又是这一焦点的核心,每年都会有众多的人群受到食源性致病菌的毒害,因此,能够方便、快速的检测出食源性致病菌将是大势所趋。就目前而言,食源性致病菌的快速检测技术要从快速增菌和快速检测两个方向入手,如何能够在短时间内大量增菌,如何能够快速、简捷的分离提取出致病菌,将是阻止疾病暴发的关键存在点。通过查阅文献,2000～2010年这十年间,前增菌的研究几乎是一个空白,因此,前增菌液的研究将是以后研究的又一重点,其研究的方向有以下几点。第一,单菌检测的前增菌液种类繁多,要选定一种对单菌菌属有增菌效果的增菌液并进行改良。第二,共增菌的增菌液仍需要进一步研究,达到最终可以同时富集5种或5种以上菌体。第三,将增菌方法与完善的检测方法合理的结合,最终达到快速检测的目的。

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Research progress in the pre-enrichment of rapid detection of foodborne pathogenic bacteria

QIAN Hong-mei1,HU Wen-zhong2,*,FENG Ke3,Sa-ren-gao-wa3,SHAO Wen-jun2

(1.College of Food Science,Dalian Polytechnic University,Dalian 116600,China;2.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China;3.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

In recent years,the food poisoning and deaths caused by food-borne pathogens have frequently occurred in the world,serious harm to human health,food-borne microorganisms have become the No.1 killer of human health. At present,the research on the technology of food-borne pathogenic bacteria detection has become a hot spot for international scholars,and the focus of the research is on rapid detection technology. However,in the rapid detection,especially molecular biology techniques,pre-enrichment process is required,how to shorten the pre-enrichment time and improve the enrichment effect is a problem to solve that in the development of rapid detection. In this paper,outbreaks ofSalmonella,Staphylococcusaureus,Listeriamonocytogenes,VibrioparahaemolyticusandShigellaare discussed and focused on the status of the pre-enrichment of first four bacteria,in order to acquaintance the existing of pre-enrichment of rapid detection and achieve a shorter time to detect foodborne pathogens.

food-borne pathogenic bacteria;enrichment culture;rapid detection

2015-12-09

钱红玫(1991-)，女，在读硕士，研究方向：食品质量与安全，E-mail：qhm171@126.com。

胡文忠(1959- )，男，博士，教授，研究方向：食品科学，E-mail：hwz@dlnu.edu.cn。

国家科技支撑计划项目(2012BAD38B05)；国家自然科学基金项目(31172009，31471923)。

TS255.7

A

1002-0306(2016)13-0360-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.066