分枝杆菌核糖体的制备与初步结构研究

孙锐，孙玉凡，张晓丹，陈刚，刘梦杰，李洁，张加，吴晶，张文宏，张颖，张文

1.复旦大学生物医学研究院, 上海 200032； 2.复旦大学附属华山医院, 上海 200031



·论著·

分枝杆菌核糖体的制备与初步结构研究

孙锐1,*，孙玉凡1,*，张晓丹1,*，陈刚2，刘梦杰1，李洁1，张加2，吴晶2，张文宏2，张颖2，张文1

1.复旦大学生物医学研究院, 上海 200032； 2.复旦大学附属华山医院, 上海 200031

核糖体是抗生素的主要靶点，而获得足量高纯度的核糖体是进行结构和药物研究的基础。结核分枝杆菌壁厚且生长缓慢，制备足量高纯度的核糖体具有挑战性。本研究改进并优化了核糖体纯化制备方法，通过大量培养和安全处理致病菌，应用高效破碎厚壁革兰阳性菌的技术，结合传统的蔗糖密度离心分离和蛋白液相色谱纯化技术，经多步纯化和分离，获得了高纯度和较高产率的耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌的核糖体样品，为后续生化实验和结构生物学研究提供了保证。该分枝杆菌核糖体制备方法也可应用于其他革兰阳性致病菌复合物样品的直接提纯，以及复合物特异性的进一步研究，特别是利用晶体学与冷冻电镜结合的高精度复合物结构研究，有助于揭示细菌耐药性机制及用于新型抗生素的研发。

分枝杆菌；核糖体纯化；结构生物学；抗生素耐药性

目前结核病呈高发趋势，全球每年有900 多万新发病例，死亡病例约150万。迄今已有约20亿人被结核分枝杆菌感染，而我国高达44.5%的感染率和日益严重的耐药性问题，已成为严重的公共卫生和社会问题[1-2]。因此，有必要对抗生素作用机制及耐药性分子机制进行深入研究。

蛋白质翻译是生物中心法则的重要环节，而核糖体是蛋白质翻译的分子机器。目前多达半数的抗生素以核糖体为作用靶点，因此针对蛋白质翻译及核糖体结构的研究不仅具有生物学意义，还具有重要医药研发价值[3]。自2000年以来，高精度的核糖体结构功能研究取得了一系列重要成就，但针对大多数致病菌核糖体结构的特异性研究不多[4-5]。通过X线晶体学，特别是最近1年的冷冻电镜技术(cryo-electron microscopy，Cryo-EM)，核糖体及其蛋白结构的研究取得了革命性突破，多种核糖体的高精度结构不断被国际顶级杂志报道[6]。本课题组利用冷冻电镜技术对多种致病菌的核糖体进行研究，旨在揭示核糖体与抗生素的特异作用机制，从而有利于开发新型窄谱抗生素。

结核病由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)引起，Mtb对大部分针对核糖体的抗生素(如链霉素等)已产生耐药性，因此有必要针对Mtb核糖体结构，研究抗生素的特异性和作用机制[7]。耻垢分枝杆菌是Mtb的近缘细菌，因为生长较快常作为Mtb研究的替代模型，两者核糖体的同源性较高，但部分序列和抗生素谱存在差异，如吡嗪酰胺对Mtb核糖体蛋白RpsA的特异作用[8]。

Mtb培养约4周才能获得足量的核糖体进行实验。即使研究减毒株H37Ra，大量培养和处理也需在满足生物安全的专门实验室中进行。传统核糖体提纯主要是将破菌后的样品经历几次密度梯度离心；而Mtb的细胞壁非常致密，很难充分破碎，且破碎的大量细胞壁残渣混合在样品中给后续纯化造成困难。因此，如何获得大量高纯度的Mtb核糖体是具有挑战性的问题，也是生化和结构生物学研究的关键[9]。

最近报道放线菌和结核分枝杆菌核糖体可获得10 Å左右低分辨率的电镜结构[10-11]，其中应用了密度梯度离心和疏水柱纯化方法，但存在不足。本研究改进了Mtb和耻垢分枝杆菌核糖体的纯化与制备方法，获得了纯度较高的样品，并用于进一步的高精度结构研究。下面主要以Mtb为例，对分枝杆菌的核糖体纯化制备进行阐述。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和培养基Mtb减毒株H37Ra由复旦大学附属华山医院感染科保存。ADC增菌液由50 g牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、20 g右旋葡萄糖(dextrose)、0.04 g过氧化氢酶(catalase)、 8.5 g NaCl配制。7H11固体培养基由10.5 g Difco Middlebrook 7H11 琼脂、450 mL H2O、5.0 mL 50%甘油配制。

1.1.2主要试剂溶菌酶购自Sigma，DNase Ⅰ购自NEB，苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)和TCEP均购自Sigma。缓冲液A：20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、100 mmol/L NH4Cl、10 mmol/L MgCl2、2 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)；缓冲液AS：缓冲液A、5%蔗糖；缓冲液BS：20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、500 mmol/L NH4Cl、10 mmol/L MgCl2、2 mmol/L EDTA、0.5 mol/L蔗糖； 缓冲液CS：20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、60 mmol/L NH4Cl、6 mmol/L MgCl2、2 mmol/L EDTA、0.7 mol/L蔗糖。

◎布洛芬 39oC以上使用，常见的就是强生的美林，小儿退热的首选。经肾脏代谢，腹泻时身体本身就容易脱水，禁用。

1.2核糖体样品的纯化

核糖体的提纯与传统方法类似[9,12]，先经细菌培养、破碎、离心、纯化，然后通过改进的AKTA纯化，最后进行浓缩、缓冲液更换等，有时还需后续密度梯度离心。

1.2.1H37Ra的培养保种菌液按1%～4%接种至300 mL 7H9液体培养基中，37 ℃静置培养4周。复苏后的菌液按4%接种至300 mL 7H9液体培养基中，37 ℃静置培养2周。每瓶(300 mL)加入20%甘氨酸22.5 mL，37 ℃ 100 r/min震荡离心，再培养1～2周。离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤，离心3次，于-80 ℃保存[13]。

1.2.2H37Ra的破碎与离心H37Ra的破碎和处理需在生物安全二级实验室中进行。将培养的3 L菌液经离心收集，取沉淀中的菌体5～10 g(湿重)，用缓冲液A洗2～3次并重悬，加入终浓度为2～5 mg/mL的溶菌酶、2 mmol/L PMSF、100 μL DNase Ⅰ(1 000 u/mL)和缓冲液AS。用改装的Beadbeater破碎仪分几次破碎，注意检查破菌瓶的密封性，并将仪器密封，防止菌液泄漏(避免风扇吹出可能形成危险的气溶胶)，破菌过程中用干冰冷却保持低温。以上操作需在生物安全柜中操作。装样品的离心管在拿出安全柜前需检查密封情况，并用乙醇喷涂进行彻底消毒。

破菌后用台式离心机(Beckman)以6 000 r/min离心10 min，弃沉淀，上清液呈棕黄色。将上清液继续用高速离心机(Beckman)以20 000 r/min离心1～2次，每次60～90 min，直至看不到明显的棕黑色沉淀，此时上清液呈淡黄色，约100 mL。用注射器抽取上清液，以0.22 μm的一次性滤膜(Millipore)过滤，取新滤膜重复过滤一次，确保上清液中无菌体残留。对使用过的滤膜用大肠埃希菌菌液进行抽滤以验证完好性，并将过滤液体涂平板过夜，如果无菌斑生长，样品方可在普通实验室中处理。

对抽滤的上清液进行蔗糖密度梯度离心。将样品分装至6支离心管(Beckman)中，下层分别加入缓冲液BS、缓冲液CS。用超速离心机(Beckman XL100)以28 000 r/min 离心过夜，次日弃上清液。如沉淀中覆盖有少量黄色杂质，需小心洗2次。最后将沉淀用缓冲液 C(无蔗糖的缓冲液CS)重悬备用。

1.2.3AKTA液相色谱纯化利用AKTA Purifier进行离子交换层析，使用SourceQ 10/10阴离子交换柱进行样品纯化。先用缓冲液C将样品稀释至20 mL，上样并平衡后，用NH4Cl溶液进行线性洗脱(将洗脱液浓度从0至75%线性提高)。洗脱液A为缓冲液C；洗脱液B为将缓冲液C的NH4Cl含量提高至1.0 mol。在几个紫外高峰附近收集样品，通过琼脂糖凝胶电泳检测核糖体RNA，确认后的核糖体样品用银染蛋白胶检测蛋白纯度和条带。

1.3核糖体样品的检测

1.3.2电镜负染检测将负染铜网进行亲水化处理后，吸取10 μL核糖体样品(约50 μg/mL)加至铜网上，静置1 min，用滤纸从铜网边缘小心吸去样品。吸取2～3 μL乙酸铀(2%)，从铜网一侧小心加上并同时从另一侧用滤纸小心吸去，以达到清洗样品的目的，重复一次。待两次清洗完毕，立即加6～8 μL乙酸铀，静置1 min。小心吸去所有染液，于干燥环境中晾干或快速烤干，然后在120 kV电镜(Tecnai G2 Spirit 120 kV)下观察。

2　结果

2.1AKTA液相色谱纯化结果

核糖体样品经密度梯度离心粗提后，仍存在淡黄色杂质，需进行阴离子交换柱纯化以提高纯度。粗提的核糖体经线性阴离子交换柱纯化，首先洗脱的是常见的杂蛋白和破碎的细胞壁，洗脱液B达55%～63%(对应电导70～78 mS/cm)时的洗脱峰为核糖体的洗脱峰，其后还有一个核酸杂质的洗脱峰。将样品分管收集后，分别鉴定其中的核酸与蛋白(图1)。

2.2核糖体样品的rRNA与蛋白检测结果

从琼脂糖凝胶电泳结果(图2)可看出，第2个条带B11存在明显的23S和16S条带，对应图1的第3个紫外峰；条带3的核酸量很少；条带4和5为杂质(核糖体前的两个小峰为常见杂质，鉴定图示略)；条带6和7分别为大肠埃希菌和耻垢分枝杆菌核糖体样品，耻垢分枝杆菌核糖体上样明显过量。胶图下部显色较淡，与染色不均匀有关。所用的15 kb DNA Marker对rRNA只有相对参考作用，故分子量标注略去。

将纯化后的核糖体样品通过Millipore浓缩管进行离心浓缩，并换为缓冲液C，与耻垢分枝杆菌和大肠埃希菌的样品进行银染胶比较(图3)。尽管Mtb与耻垢分枝杆菌的同源性较高，但从胶图上可观察到3种核糖体的部分蛋白大小有差别。对图中部分条带进行质谱验证，并将Mtb和耻垢分枝杆菌的基因组抽提后对核糖体序列进行测序，验证同样正确。

The ribosome is detected in peak 3 (around tube B11), and the other peaks are contaminations, which are identified by RNA and protein gel.

图1Mtb核糖体阴离子交换柱分析

Fig.1Analysis of Mtb ribosome by ChromatographySource Q

M: 15 kb DNA Marker; Lanes 1-7: Input/B11/B10/B9/B8/Ec70S/MS70S, in which lanes 2-5 are Mtb samples labeled with tubes from ChromatographySource Q, Ec and MS areE.coliandM.smegmatissamples, respectively.

图2Mtb核糖体的琼脂糖凝胶分析

Fig.2Agarose gel of Mtb ribosome samples from Chro-matographySource Q

2.3核糖体的电镜负染结果

图4为Mtb核糖体的电镜负染结果，可看到清晰的核糖体，还可看到杂质颗粒，在铜网的不同区域背景中颗粒有多有少。最近通过高分辨冷冻电镜(FEI Titan Krios 300 kV)并未观察到类似的杂质颗粒， 完全满足高精度数据处理的要求。负染背景

中可能混入制样时产生的部分杂质。样品存在部分分离的亚基，电镜可将其完全分开。对产量较大的耻垢分枝杆菌核糖体，可通过密度梯度离心将30S、50S和70S分开，且纯化的70S生长晶体可用于进一步实验。而电镜可在30S、50S和70S混合情况下收集数据，通过分类解析所有结构。

M: Marker; Lane 1: Buffer C as control; Lane 2:M.smegmatis; Lanes 3 and 4:E.coli; Lane 5: Mtb. TheOD260value is about 8.0 for lanes 2, 4, 5, and about 4.0 for lane 3.

图3Mtb核糖体的银染凝胶图

Fig.3Silver staining of ribosome samples

The major particles are identified as Mtb ribosome 70S.

图4Mtb核糖体的负染图

Fig.4Negative staining of Mtb ribosome samples

3　讨论

随着细菌耐药性问题的日益严重，新型抗生素研发的速度远远赶不上细菌产生耐药性的速度，有的新药在临床试验期间就出现了耐药性。因为治疗结核病时间长达6个月以上，长期服药可能导致更严重的广谱耐药。基于细菌耐药性的危险，美国和欧洲积极推进相关研究和新型抗生素的研发[14-15]，基于结构的抗生素研发也得到重视并取得进展[3]。

经过10多年的努力，核糖体高精度的结构研究逐渐揭开了多种抗生素对核糖体翻译的抑制机制。因为使核糖体结晶的难度很大，核糖体结构研究主要局限于大肠埃希菌、嗜热菌等少数物种，对抗生素的物种特异性或对致病菌的抗生素谱还不很清楚。最近1年多来，随着电镜技术在高精度结构解析中取得的突破，使致病菌核糖体不需结晶即可获得高精度的结构。结核病为全球第二大致命流行传染病，但由于Mtb核糖体纯化困难，目前还未获得高精度结构。因此，如何制备Mtb核糖体并提高纯度和获得足够样品，对研究Mtb的耐药性具有重要意义。

以往核糖体纯化结构研究主要运用密度梯度离心和疏水柱的方法。但密度梯度离心不能完全除去细胞残渣、大片段降解的核酸杂质等；疏水柱的高盐条件会使一部分核糖体蛋白、结合因子解离，除嗜热菌等非常稳定的核糖体，核糖体易变得不完整[10-11]。

传统的核糖体制备过程中，在蔗糖密度梯度离心、浓缩并更换缓冲液后，样品存在明显损失，进行多个步骤的离心后，最终获得的核糖体很少，5 g菌体只能获得约0.1 mg核糖体。为提高核糖体产率，本研究采取大量培养(3～5 L Mtb)，提高破壁效率，减少密度梯度离心次数，并利用阴离子交换柱实现高效、快速纯化。为提高破壁效率，还在收菌前2 d加入甘氨酸使菌体细胞壁变脆[13]。另外，在破菌时使用适量溶菌酶帮助破壁，并采用破壁效果较好的石英砂代替玻璃珠，少量多次破菌，从而有效提高了核糖体粗提产量。最终8 g菌体获得约1 mg核糖体，产量提高近10倍。从rRNA和蛋白胶图及电镜负染图可看出，经过阴离子交换柱纯化，核糖体纯度大大提高。虽然其中还存在少量分离的大小亚基，但一般不影响电镜研究。

耻垢分枝杆菌与Mtb的核糖体纯化方法类似，因为耻垢分枝杆菌的核糖体含量高，经上述优化后产量提高，一般可考虑后续的密度梯度离心，进一步分离核糖体30S、50S和70S。用改进方法获得的70S最终产量可由0.5 mg提高至近10 mg，足够进行结晶实验。目前，耻垢分枝杆菌核糖体晶体已筛选到较小的微晶，还需进一步优化结晶条件，才能进行下一步的晶体衍射实验。

核糖体是蛋白质翻译的大分子机器，翻译过程含有多个复杂的动态过程。近年来对其延伸过程的研究取得了很大进展，同时揭示了抗生素抑制翻译的新机制。抗生素可能结合于核糖体的多个作用位点，参与并影响多个翻译步骤中的动态过程，如氨基糖苷类抗生素对翻译识别、延伸、循环回收的抑制和影响[16]。其对研究致病菌高精度动态结构、抗生素作用机制和耐药机制具有重要意义，与深入研究翻译机制也相辅相成[17]。

本研究改进了Mtb核糖体提纯方法，该方法也可用于一般的革兰阳性菌研究。目前，除了对大肠埃希菌和嗜热菌等少数物种的核糖体可进行晶体结构研究和药物筛选外，对其他重要的致病菌核糖体可利用电镜进行高精度快速解析。近1年多来，电镜结构解析技术取得突破性进展。由于照相机和软件处理技术的进步，冷冻电镜可快速解析高精度的大型复合物，《科学》杂志将电镜技术的进步称为分子生物学上重要的“精度革命”，为致病菌核糖体研究提供了可靠保证[18]。短短1年多，通过电镜技术已解析了多个重要的大型复合物，如剪接体结构、线粒体核糖体结构和人核糖体结构等[6]。目前核糖体结构电镜分辨率已达2.6～2.9 Å，核心部位能直接观察到甲基化[19]，这对理解抗生素与核糖体作用的物种特异性及突变和甲基化引起的耐药性非常重要。特别是冷冻电镜可直接研究核糖体的溶液构象，解析生理条件下核糖体与抗生素等小分子复合物的结构和多种动态构象。将来所有物种的核糖体都能很快得到解析，对研究重要致病菌的核糖体特异性药谱和新型窄谱抗生素研发具有重要意义，以结构为基础的抗生素研发也有望得到飞速发展[20-21]。

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Ribosome preparation fromMycobacteria

SUN Rui1,*, SUN Yufan1,*, ZHANG Xiaodan1,*, CHEN Gang2, LIU Mengjie1, LI Jie1, ZHANG Jia2, WU Jing2, ZHANG Wenhong2, ZHANG Ying2, ZHANG Wen1

1. Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2. Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200031, China

Ribosomes of pathogenic bacteria are major targets for antibiotics, and how to prepare ribosome samples with quality and quantity is a key step for structure and antibiotic studies. In particular, it is a challenge to purify enough ribosome from slow-growingMycobacteriumsuch asMycobacteriumtuberculosisdue to slow growth rate and thick cell wall. With the optimized steps, including growing and processing bulk culture with biosafety measures, breaking the thick cell wall of Gram-positive bacteria with effective techniques, and purification methods to combine the fast protein liquid chromatography (FPLC) and sucrose gradient separation, enough ribosome samples with high purity were obtained fromMycobacterium. The prepared samples could be subjected to complex specificity studies, such as high-resolution structure studies with X-ray crystallography and cryo-electron microscopy (cryo-EM), and shed light on the mechanism of antibiotics. This improved method is applicable in other Gram-positive bacteria.

Mycobacterium; Ribosome preparation; Structural biology; Antibiotic resistance

国家自然科学基金(11179012)，国家重点基础研究发展计划(2011CB710801)

张文，张颖

Corresponding authors. ZHANG Wen, E-mail: wenz@fudan.edu.cn; ZHANG Ying, E-mail: yzhang5@jhu.edu

2015-03-13)

*同为第一作者