A类Ⅰ型清道夫受体调节小鼠腹腔巨噬细胞抗肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌感染

肖海涵，范霞，郭明权，罗婷婷，夏碧丽，何平

上海交通大学医学院免疫学与微生物学系，上海 200025



·论著·

A类Ⅰ型清道夫受体调节小鼠腹腔巨噬细胞抗肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌感染

肖海涵，范霞，郭明权，罗婷婷，夏碧丽，何平

上海交通大学医学院免疫学与微生物学系，上海 200025

本研究旨在探讨A类Ⅰ型清道夫受体(scavenger receptor class A type I，SR-AI)在呼吸道感染常见病原体肺炎克雷伯菌及铜绿假单胞菌感染过程中的免疫调节功能。以肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌临床分离株与野生型小鼠和SR-AI-/-小鼠腹腔原代巨噬细胞互作，研究SR-AI在吞噬和炎症反应中的作用。荧光染料染色菌体及检测胞内荧光强度，数据显示SR-AI敲除后巨噬细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬能力下降，但对铜绿假单胞菌的吞噬能力升高。采用实时定量荧光聚合酶链反应检测相关炎症因子mRNA水平，发现SR-AI敲除后肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌刺激巨噬细胞引发的炎症反应均增强。结果表明，SR-AI参与巨噬细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬，但不参与对铜绿假单胞菌的吞噬，且可能抑制了肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌引发的炎症反应。

小鼠巨噬细胞；A类Ⅰ型清道夫受体；肺炎克雷伯菌；铜绿假单胞菌；吞噬；炎症反应

A类Ⅰ型清道夫受体(scavenger receptor class A type I, SR-AI)是一种主要表达于机体巨噬细胞和内皮细胞中的三聚体跨膜蛋白受体，也是一种重要的模式分子识别受体。其胞外结构功能域具有广泛的配体结合性，包括细菌及其病原体相关模式分子，如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、外膜蛋白等，可介导细胞的吞噬和消化，在宿主防御和天然免疫方面发挥重要作用[1-4]。肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,K.pneumoniae)为革兰阴性菌, 属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)克雷伯菌属；铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa)为中等大小的革兰阴性杆菌，属假单胞菌属，是一种机会致病菌，广泛存在于医院环境中[6-7]。两者均为临床常见的呼吸道病原体[8-10]，但与SR-AI的相互作用尚不清楚。本研究通过探讨SR-AI与肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌之间的相互作用，了解SR-AI在呼吸道感染中的作用，加强对机体天然免疫与呼吸道病原菌相互作用的认识。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌自呼吸道感染患者中分离获得，分别由复旦大学附属华山医院检验科和上海交通大学医学院附属仁济医院崇明分院检验科赠予，由梅里埃公司VITEK MS全自动快速微生物质谱检测仪加以鉴定和验证。

1.1.2巨噬细胞SR-AI-/-腹腔巨噬细胞取自6～8周龄SR-AI-/-C57BL/6小鼠，由南京医科大学江苏省心血管病与分子干预重点实验室杨惠老师馈赠。小鼠为实验清洁级。实验许可证：SYXK(苏)2008-0004。SR-AI-/-小鼠背景信息见https://www.jax.org/strain/006096及相关文献[1]。野生型原代腹腔巨噬细胞取自与SR-AI-/-小鼠有相同背景的6～8周龄C57BL/6小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司。小鼠为实验清洁级。生产许可证：SCXK(沪)2007-0005；实验许可证：SYXK(沪)2008-0038。

1.1.3试剂及耗材主要试剂有DMEM高糖型培养基(Corning，10-013-CVR)、RPMI 1640培养基(Gibco，C22400500BT)、胎牛血清(Gibco，10099141)、青/链霉素双抗(Gibco，15140-122)、TriPure Isolation Reagent(Roche，11667165001)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo，#K1622)、Faststart Universal SYBR Green Master(ROX)(Roche，11929100)、DEPC水(Ambion，AM9915G)、巯基乙酸钠(BD，211716)、LB培养基〔自配，其中NaCl购自生工生物工程(上海)股份有限公司、胰蛋白胨和酵母提取物购自Oxoid公司〕、异丙醇(上海凌峰化学试剂有限公司)、多聚甲醛(上海凌峰化学试剂有限公司)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)(碧云天生物技术公司，ST511)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(碧云天生物技术公司，C1002)。细胞培养所用10 cm培养皿、12孔培养板及24孔培养板均购自Corning公司。

1.1.4引物合成及序列引物由美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站在线引物设计工具设计，Invitrogen上海分公司合成。相关引物见表1。

1.1.5仪器和设备主要仪器和设备有台式低温离心机(Thermo)、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪(Applied Biosystems)、荧光 定量PCR仪(ABI 7500 Fast)、核酸测定仪(Nanodrop，Thermo)、激光扫描共聚焦显微镜(Leica TCS SP8)、CO2恒温细胞培养箱(Thermo)等。

1.2方法

1.2.1细菌培养挑取肺炎克雷伯菌及铜绿假单胞菌单克隆，接种于LB培养基中，37 ℃培养至对数期。

1.2.2PI染色PI是一种荧光染料，易与DNA和RNA结合，在最大激发波长535 nm处释放红色荧光。PI染色方法参考相关文献[12]，具体如下。取对数期生长的菌液，离心收集，弃上清液，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)重悬；60 ℃热灭活30 min，冷却后加入PI染料至终浓度为50 g/mL，常温避光振荡孵育30 min；离心，PBS洗4次，PBS重悬，4 ℃储存备用。

表1RT-PCR引物

Tab.1Primers used for RT-PCR

GenePrimerSequence(5'-3')B2mForwardCTGCTACGTAACACAGTTCCACCC(reference)ReverseCATGATGCTTGATCACATGTCACGIL-1βForwardGAAATGCCACCTTTTGACAGTGReverseTGGATGCTCTCATCAGGACATIL-6ForwardTAGTCCTTCCTACCCCAATTTCCReverseTTGGTCCTTAGCCACTCCTTCIL-12βForwardTGGTTTGCCATCGTTTTGCTGReverseACAGGTGAGGTTCACTGTTTCT

1.2.3小鼠腹腔巨噬细胞收集取成年健康雌性野生型和SR-AI-/-小鼠，每只腹腔注射1 mL 5%巯基乙酸钠溶液，饲养4 d后处死，收集腹腔巨噬细胞。

1.2.4吞噬菌体实验将圆形玻片预先放入24孔细胞培养板，再铺入小鼠腹腔巨噬细胞(每孔2×105个细胞)，过夜培养；将细胞培养基换为无血清培养基，按感染复数(multiplicity of infection，MOI)=20∶1(菌体数∶细胞数)比例加入经PI染色的菌体，1 000 r/min离心3 min，37 ℃共孵育40 min。4%多聚甲醛固定，DAPI染核后用抗荧光淬灭剂封片，激光共聚焦显微镜进行荧光观察并计算吞噬量。

1.2.5PCR检测巨噬细胞炎症因子mRNA表达水平将细胞按5×105个/孔铺入12孔板，培养箱中过夜培养。用PBS洗去未贴壁细胞，重新加入新鲜培养基，以MOI=20∶1(细菌数∶细胞数)比例加入经4%多聚甲醛固定的菌体，37 ℃共培养。在规定时间收集经细菌刺激的细胞，用TriPure Isolation Reagent裂解液裂解，按产品说明书抽提总RNA。按RNA反转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)说明书，将500 ng RNA经随机引物反转录成cDNA，分别对白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-6及IL-12β基因进行实时荧光定量PCR，检测mRNA表达水平。

1.3统计学分析

2　结果

2.1SR-AI在小鼠腹腔巨噬细胞吞噬肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌中的作用

荧光电镜观察巨噬细胞吞噬肺炎克雷伯菌发现，吞噬后野生型小鼠腹腔巨噬细胞比SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬细胞有更强的红色荧光。荧光强度统计分析显示，每个野生型小鼠腹腔巨噬细胞吞噬的菌体平均荧光强度值为12，而每个SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬细胞吞噬的菌体平均荧光强度为8，表明SR-AI可提高巨噬细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬能力(图1A)。

荧光电镜观察巨噬细胞吞噬铜绿假单胞菌发现，吞噬后SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬细胞比野生型小鼠腹腔巨噬细胞有更强的红色荧光。荧光强度统计分析显示，每个野生型小鼠腹腔巨噬细胞吞噬的菌体平均荧光强度值为3，而每个SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬细胞吞噬的菌体平均荧光强度为6，表明巨噬细胞中SR-AI对铜绿假单胞菌的吞噬能力没有增加作用，反而有潜在的抑制作用(图1B)。

2.2SR-AI在肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌引发炎症反应中的作用

在菌体体外刺激巨噬细胞所引发炎症反应的研究中，肺炎克雷伯菌刺激野生型小鼠和SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬8 h后，SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬细胞中的IL-1β、IL-6和IL-12β mRNA表达量明显高于野生型小鼠。同样结果见于铜绿假单胞菌刺激野生型小鼠和SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬细胞所引发的炎症反应中，刺激后8 h，SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬细胞中

A:K.pneumoniae. B:P.aeruginosa. Blue indicates nucleus, red indicates bacteria.

图1野生型小鼠和SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬细胞对肺炎克雷伯菌及铜绿假单胞菌的吞噬

Fig.1The phagocytosis ofK.pneumoniaeandP.aeruginosaby peritoneal macrophages from wide-type andSR-AI-/-mice

A:K.pneumoniae. B:P.aeruginosa.*P<0.05.

图2肺炎克雷伯菌或铜绿假单胞菌感染后野生型小鼠和SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬细胞中炎症因子的mRNA水平

Fig.2mRNA levels of inflammatory cytokines in peritoneal macrophages from wide-type andSR-AI-/-mice after infection ofK.pneumoniaeorP.aeruginosa

IL-1β、IL-6和IL-12β mRNA表达量明显高于野生型小鼠。由此可见，SR-AI敲除后，肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌刺激腹腔巨噬细胞导致的炎症反应增强(图2)。

3　讨论

巨噬细胞对病原体的吞噬是天然免疫的重要组成部分，已发现多种吞噬相关受体，如Fc受体、整合素、凝集素、甘露糖受体等，与配体结合后可引起细胞骨架运动，启动细胞吞噬[13-14]。SR-AI为一种模式分子识别受体，与配体结合被激活后，能发挥非调理型吞噬功能，提高细胞吞噬功能[1-2]。本研究显示，SR-AI敲除后，巨噬细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬能力明显降低，表明SR-AI能识别肺炎克雷伯菌并参与巨噬细胞对其吞噬。与肺炎克雷伯菌不同，SR-AI敲除后巨噬细胞对铜绿假单胞菌的吞噬没有减少反而增加，推测SR-AI可能不参与铜绿假单胞菌的吞噬。据相关研究报道，SR-AI敲除后MARCO受体(SR-A类受体家族的另一成员)表达量升高[15]，推测MARCO受体可能参与铜绿假单胞菌的吞噬，此假设还需进一步验证。

SR-AI胞内段缺乏信号修饰位点，本身并不直接激活炎症信号通路，只能协同参与其他炎症信号通路(如Toll样信号通路)[2,15]。一些相关研究发现其能参与调节炎症因子的表达[15-20]。有研究发现，SR-AI被激活后能抑制炎症反应[15,17,20]，但也有研究发现SR-AI被激活后能促进炎症反应[16,18-19]。目前对SR-AI的作用尚存在争议，其也因此被看作是一种多功能受体。

本研究发现SR-AI具有调节炎症反应的作用。肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌刺激后，SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子IL-1β、IL-6和IL-12β的表达比野生型小鼠明显升高，表明SR-AI可能具有抑制肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌引发炎症反应的作用。有研究发现，在肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌感染动物模型中，两者感染能导致机体肺部炎症因子升高[21-23]，而较高的炎症因子表达量往往使器官损伤[24]。在肺部炎症中，较高炎症因子往往与疾病严重程度相关[25-26]，特别是IL-1β表达与肺部损伤直接相关[27]。从这个意义上来说，SR-AI在肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌感染过程中抑制炎症因子表达可能是对机体的保护，能防止炎症因子过量表达对肺部造成的损伤。

综上所述，本研究表明SR-AI能参与巨噬细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬，但不参与对铜绿假单胞菌的吞噬，同时可能具有抑制肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌引发炎症反应的功能，从而对肺部起保护作用。

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Role of scavenger receptor class A type I in regulating murine peritoneal macrophages againstKlebsiellapneumoniaeandPseudomonasaeruginosainfection

XIAO Haihan, FAN Xia, GUO Mingquan, LUO Tingting, XIA Bili, HE Ping

Department of Microbiology and Immunology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025, China

The aim of this study is to investigate the immune regulation function of scavenger receptor class A type I (SR-AI) on macrophages for the treatment of two common pathogens of respiratory tract:Klebsiellapneumoniae(K.pneumoniae) andPseudomonasaeruginosa(P.aeruginosa). The clinical isolates ofK.pneumoniaeandP.aeruginosawere collected. They were stained by fluorescent dyes and subjected to the peritoneal macrophages prepared from wide-type (WT) andSR-AI-/-mice respectively. The results showed thatSR-AI-/-macrophages had lower phagocytic ability toK.pneumoniae, but higher phagocytic ability toP.aeruginosathan WT macrophages. Quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-qPCR) was used to detect mRNA expressions of inflammatory cytokines. The results showed that the inflammatory reactions ofSR-AI-/-macrophages were significantly improved than WT macrophages after infection ofK.pneumoniaeandP.aeruginosa. The data suggest that SR-AI could participate in the phagocytosis ofK.pneumoniaeby macrophages, but not in the phagocytosis ofP.aeruginosa. Besides, SR-AI plays a role in downregulation of inflammatory reactions induced by infection ofK.pneumoniaeandP.aeruginosa.

Murine macrophage; Scavenger receptor class A type I;Klebsiellapneumoniae;Pseudomonasaeruginosa; Phagocytosis; Inflammation

国家自然科学基金(81471908)

何平

Corresponding author. HE Ping, E-mail: hpatsh@sjtu.edu.cn

2016-04-22)