严重发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）总抗体检测试剂盒（ELISA）的研制

马玉英

（宁夏贺兰县农牧渔业局动物卫生监督所，宁夏 贺兰 750200）

试验研究

严重发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）总抗体检测试剂盒（ELISA）的研制

马玉英

（宁夏贺兰县农牧渔业局动物卫生监督所，宁夏 贺兰 750200）

为建立检测严重发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）血清总抗体的双抗原夹心ELISA方法并进行初步试用，通过原核表达得到SFTSV-NP重组蛋白，以该蛋白作为ELISA的包被和酶标记抗原，确定抗原的最佳包被浓度和血清稀释度，优化各项试验条件，在此基础上研制试剂盒，并对试剂盒的重复性、特异性等方面进行研究。结果发现抗原最适包被浓度为4.0 μg/ml，血清的最佳稀释浓度为1∶40，重复性试验表明批内和批间的变异性都低于10%。该试剂盒敏感性高、特异性强、重复性良好，可应用于SFTSV的研究和临床检测。

严重发热伴血小板减少综合征病毒；抗体；酶联免疫吸附试验

近几年来，我国湖北、河南、山东等地相继发现一些以发热伴血小板减少为主要表现的感染性疾病病例，该病的主要传播途径为蜱虫的叮咬。2010年5月，中国疾病预防控制中心将该病毒引起的病例定义为“严重发热伴血小板减少综合征”，并开展了病例的主动发现、搜索等监测工作［1-2］。从病人血清中分离到1株病毒，并完成了病毒的全基因序列测定和同源性比较，通过对病毒基因结构和形态特征的详细分析，确定该病毒为一种新型布尼亚病毒［3］。2011年3月17日出版的国际权威医学刊物《新英格兰医学杂志》刊登了该研究成果，这是国际上首次报道这一布尼亚科病毒。

到目前为止，该病毒的检测方法还很有限，主要有PCR检测、免疫荧光检测（IFA）、血清学检测、电子显微镜检测等［4］。然而这几种检测方法均存在一些缺陷，如病毒核酸检测程序繁琐，耗时耗力且对仪器的要求高，电子显微镜检测费用高且检测灵敏度低，要求检测者有熟练的技术［5］，不利于SFTSV的快速检测和诊断。研制操作简便、敏感性高、特异性好、能快速诊断SFTSV的试剂盒和监测方法十分必要。该项目以ELISA双抗原夹心法，检测患者血清中是否存在SFTSV抗体，以确定患者是否感染或曾经感染过SFTSV，从而为临床诊断提供帮助。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病毒、血清

SFTSV毒株、阳性血清均由江苏疾病预防控制中心病原微生物研究所保存。

1.1.2引物、原核表达载体

引物、原核表达载体pET28a-NP均由江苏疾病预防控制中心病原微生物研究所构建。

1.1.3试剂及主要仪器

病毒TRNA提取试剂Trizol、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自大连宝生物工程有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）、弗氏完全、不完全佐剂购自美国Sigma公司；PCR仪：德国Biometra公司产品；恒温仪、离心机：德国Eppendorf公司产品；DEM-Ⅱ自动酶标洗板机：北京拓普生产；MODEL 680型酶标仪；96孔可拆式ELISA酶标板：丹麦NUNC公司生产。

1.2方法

1.2.1制备重组抗原

根据Trizol试剂说明书从血清中提取总RNA，通过RT-PCR技术扩增出SFTSV-NP基因，分别用限制性内切酶BamH I、EcoR I酶切上述扩增片段与质粒pMD18-T，回收目的基因和载体片段，进行连接反应。将连接产物转化感受态宿主菌E.coli DE3，挑取经酶切鉴定的单个白色菌落，37℃培养至OD600 nm为0.4～0.6时，加ITPG 37℃诱导6 h，收集菌体，纯化目的蛋白，具体操作步骤参考文献［6-8］。

1.2.2酶标记抗原

对表达纯化的NP重组蛋白采用过碘酸钠法标记辣根过氧化物（HRP），经Supperdex 200分子筛分离纯化，方法参考文献［9］。

1.2.3ELISA各项试验条件的优化

1.2.3.1ELISA抗原包被浓度和血清稀释度确定

以方阵滴定试验检测抗原的最佳包被浓度和血清最适稀释度。横排为不同稀释浓度的重组蛋白（8.0 μg/ml、6.0 μg/ml、4.0 μg/ml、2.0 μg/ml、1.0 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml），纵排分别加入1∶20、1∶40、1∶80、1∶160倍比稀释的SFTSV阳性血清和阴性血清。计算阳性血清孔的平均OD450 nm值（P）和阴性血清孔的平均OD450 nm值（N）之比（P/N），比值最大孔的抗原浓度和血清稀释倍数即为最佳。

1.2.3.2酶标抗原的最佳使用浓度

将酶标抗原进行不同浓度的稀释，各取1滴加入系统采用的1 ml底物液中，迅速混匀后观察颜色变化，在1～1.5 min内出现明显颜色变化的二抗浓度，也就是最佳的酶标抗原使用浓度。

1.2.3.3在已确定的各种条件下，选择适合的封闭液和稀释液

分别用5%～10%脱脂奶粉、5%～10%马血清、1%白明胶、1%BSA作封闭液；用1%～5%脱脂乳、3%～5%马血清、0.1%白明胶、0.1%BSA作稀释液，测450 nm的OD值，选本底值、P/N值大、OD值最高者为最适。

1.2.3.4各个步骤作用时间的选择（选择本底值低、P/N比值最高者为最适作用时间）

包被条件：其他条件不变，选4℃过夜、37℃作用1 h 后4℃过夜、37℃作用2 h，这3个梯度；

封闭时间：设0.5 h、1 h、2 h、4 h，共4个梯度；

血清样品反应时间：设10 min、20 min、30 min、40 min，共4个梯度；

酶标抗原作用时间：设30min、1h、2h，共3个梯度；

显色时间：设显色时间分别为5 min、8 min、10 min、12 min、14 min，共5个梯度。

1.2.3.5临界值的确定

随机挑取SFTSV抗体阳性血清20份，抗体阴性血清80份，以优化的抗原包被量和血清工作浓度对血清进行ELISA检测，测定450 nm的OD值，计算阴性血清的平均OD值（）和标准偏差（SD），求得阴阳性判定界限x±3SD。

1.2.4试剂盒总体性能评价

1.2.4.1特异性试验

用组装完成的试剂盒对可以引起出血热的病毒、细菌进行检测（例：肾综合征出血热（HERS）病毒、流感病毒、钩端螺旋体），同时选20份SFTSV阴性血清，对试剂盒的特异性进行检测。

1.2.4.2敏感性试验

其他反应条件均在最适的情况下，将阳性血清1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560、1∶5120稀释8个梯度进行ELISA检测。

1.2.4.3重复性试验

批内重复试验：在同一批次内随机挑选5块ELISA试剂盒检测已知背景的血清5份（阳性血清3份，阴性血清2份），计算“批内变异系数”。

批间重复试验：在不同批次随机抽取5个ELISA试剂盒检测已知背景的血清5份（阳性血清3份，阴性血清2份），计算“批间变异系数”。

2　结果

2.1重组抗原制备

原核表达质粒pET28a-NP转化E.coli BL21（DE3）后，经IPTG诱导获得表达蛋白与预期大小相符。表达产物经试剂盒纯化后纯化获得了较高纯度的目的蛋白。

2.2ELISA各项试验条件优化结果

从方阵滴定法检测结果表1可以看到，随着包被抗原浓度的减少和血清稀释倍数的增加，血清的OD值不断降低，当抗原包被浓度在4 μg/ml，血清稀释倍数为1∶40时，阳性血清的OD值在1.0左右，且阴性血清的OD值低，阳性阴性血清比值（P/N）高。一般情况下，ELISA检测仪在检测OD值为1.0左右时误差最小，反应最灵敏，以此为根据，选择4 μg/ml的抗原包被量为最适包被浓度，而被检血清的最佳稀释为1∶40。

当酶标抗原NP-HRP稀释到1∶1 000时与底物反应能在1～1.5 min内出现明显的颜色变化，因此将酶标抗原的工作浓度定为1∶1 000。封闭效果最好的是10%脱脂乳；0.1%BSA为样品稀释液；包被时间为37℃水浴2h；4℃封闭过夜；待检血清在37℃作用30 min及；酶标抗原在37℃作用20 min；5～8 min为最适宜显色时间。

表　方阵滴定法确定抗原最适包被浓度和血清最佳稀释倍数

2.3ELISA判定标准的确定

试验测得阴性血清OD450 nm均值范围为0.12±0.03，在此基础上确定该ELISA试剂盒的判定标准为S/N＞2.1，且阳性血清A450 nm＞0.25时则待检血清SFTSV总抗体为阳性。

2.4特异性试验

对其有出血热症的阳性血清和20份阴性血清进行检测，结果均为阴性，没有出现交叉反应。

2.5敏感性试验

通过检测倍比稀释的阳性血清，结果显示当血清稀释浓度达到1∶640时，按以上判定标准判定仍为阳性，说明该试剂盒的灵敏度为1∶640.

2.6重复性试验

用同一批次和不同批次的ELISA试剂盒对已知背景的5份血清（阳性血清3份，阴性血清2份）作批内和批间重复试验，计算得出“批内重复系数”在2.53%～5.62%，“批间重复系数”在4.17%～5.89%，重复系数都小于10%，说明试剂盒的重复性良好。

3　讨论

严重发热伴血小板减少综合征病毒简称“新布尼亚病毒”，属于布尼亚（Bunya）病毒科白蛉病毒属［2］。病毒体呈球形，直径80～100 nm，外有脂质包膜，表面有棘突。基因组包含3个单股负链RNA片段（L、M和S），L片段全长为6 368个核苷酸，包含单一读码框架编码RNA依赖的RNA聚合酶；M片段全长为3 378个核苷酸，含有单一的读码框架，编码1 073个氨基酸的糖蛋白前体；S片段是一个双义RNA，基因组以双向的方式编码病毒核蛋白和非蛋白结构［10］。病毒基因组末端序列高度保守，与白蛉病毒属其他病毒成员相同，可形成锅柄状结构［1］。

该病毒从2010年9月到2011年3月，在中国湖北、河南、山东、江苏、安徽和辽宁等6个省份导致至少36名患者死亡。主要临床表现为发热、消化道症状、血小板减少、白细胞减少、肝肾功能损害，部分患者有出血表现。该病主要发生在丘陵、山区，患者以从事农业生产的成年农民为主，部分患者被蜱叮咬。流行期为4～10月，流行高峰为5～7月［11］。

到目前为止SFTSV的研究还处于起步阶段，国内外对SFTSV的检测主要包括两方面：抗原检测和抗体检测。抗原检测是通过电子显微镜和核酸测序；抗体检测的方法主要有间接免疫荧光法（IFA），酶联免疫吸附试验（ELISA），中和试验。通常应用最为广泛的是ELISA法，但是市场内并没有商品化的SFTSV抗体或试剂盒，要对SFTSV进行检测就必须经过繁复的试验过程，且对仪器和检测员的要求都很高。

该试验使用重组蛋白NP作为包被抗原和酶标记抗原，建立了双抗原夹心ELISA法，并对其反应条件进行优化，在此基础上研制出ELISA试剂盒。通过对试剂盒的检测表明其特异性良好，未于布尼亚其他病毒发生交叉反应，并且ELISA方法的成功建立克服了其他检测法存在的缺点，该试剂盒的检出率高，费用少，对仪器及检验员的要求不高，为试剂盒的推广应用奠定了基础。

［1］发热伴血小板减少综合征防治指南.北京：中国卫生部办公厅，2010.

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［3］Zhang L，Liu Y，Ni D，et al.Nosocomial transmission of human granulocytic anaplasmosis in China［J］.JAMA，2008，300（19）：2263-2270.

［4］张丽敏.发热伴血小板减少综合征实验室检测方案［N］.中国社区医师，2010-10-24.

［5］李成，谷守林.快速检测动物病毒电镜技术［J］.中国畜禽传染病，1997，19（6）：14-19.

［6］吴守丽，何似，李世清，等.双抗原夹心法ELISA在肾综合征出血热诊断中的应用［J］.中国媒介生物学及控制杂志，2007，18（6）：492-494.

［7］张全福，李建东，李伟红，等.双抗原夹心法ELISA在检测肾综合征出血热总抗体中的应用［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2007，21（4）：386-388.

［8］J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著.分子克隆实验指南［M］.黄培堂，王嘉玺，朱厚础，等译.第3版.北京，科学出版社，2002：636-643.

［9］王学斌，刘凤莲，李东风.辣根过氧化物酶标记技术的赝象［J］.生物技术，1998，8（4）：17-20.

［10］刘雅婷，张文超，李正跃，等.布尼亚病毒科全基因组序列比对分析［J］.云南农业大学学报，2008，23（3）：315-320.

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