杜氏肌营养不良症的临床表现与基因表型的关联

季苏琼，李悦，王琼，孟丽娟，卜碧涛



·论著·

杜氏肌营养不良症的临床表现与基因表型的关联

季苏琼，李悦，王琼，孟丽娟，卜碧涛

目的：分析杜氏肌营养不良症（DMD）患者的基因突变特点，探讨疾病的临床表现与基因型的关联。方法：回顾性分析52例DMD患者的临床表现和基因特点。结果：患者多表现为肢体无力、走路姿势异常，发育迟缓，部分患者伴智力下降，心脏功能减退等。多重链接探针依赖扩增技术发现基因检测无异常4例（7.69%），DMD基因缺失40例（76.9%），重复8例（15.3%）。基因突变发生在外显子45～55 22例（40.74%），2～19区域10例（19.23%）。48例基因异常患者中，符合阅读框架原则42例（87.5%）。结论：基因缺失的大小与临床症状的关系不大，病情严重程度关键取决于突变是否会破坏阅读框结构。基因突变越接近5'端对智力的影响越轻，越接近3'端对智力的影响越重。

进行性肌营养不良；杜氏肌营养不良症基因；多重链接探针依赖扩增技术；基因缺失；基因重复

杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种由编码抗肌萎缩蛋白（dystrophy）基因突变所致的X-连锁隐性遗传性肌病，一般为男孩发病。全世界活产男性新生婴儿中的发病率约为1/3 600[1]，患者出生时多无症状，多在3～5岁发病，起病隐匿[2]。该病进展迅速，患者多在10岁需要使用轮椅生活，多于20～30岁死于心脏和呼吸衰竭[1]。

DMD基因位点位于X染色体p21.2，是迄今发现的最大的人类基因，具有极高的突变频率，主要表达在骨骼肌和心肌。主要分为三种突变类型：缺失突变、重复突变、微小突变[3]，这些突变改变了基因的阅读框架，影响抗肌萎缩蛋白的合成[4]。抗肌萎缩蛋白是一个细胞骨架蛋白，主要位于骨骼肌和心肌的细胞浆面，少量表达于脑组织，在心肌和骨骼肌上，抗肌萎缩蛋白与肌膜上的不同蛋白结合形成抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合体（dystrophin-glycoprotein complex，DGC），其对于保护肌细胞膜的结构完整和维持肌细胞正常收缩功能有重要作用。当患者因DMD基因缺陷时，DGC功能丧失，导致肌细胞坏死和功能缺失以及肌肉组织纤维化[5]。

DMD暂缺乏有效的治疗措施，因此对DMD基因突变的检测是控制和降低DMD发病率的关键。本研究回顾性分析52例DMD患者的临床特点，均采用多重链接探针依赖扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）技术检测DMD基因的缺失和重复突变，探讨疾病的临床表现与基因型的关联。

1　资料与方法

1.1一般资料

收集2010～2015年于我院基因和临床诊断为DMD的患者52例，均为男性；确诊年龄2～19岁，平均（8.2±4.90）岁；起病年龄1～18岁，平均（5.4±4.54）岁；均无血缘关系，父母非近亲结婚；有阳性家族史2例，符合X连锁隐性遗传，均表现为哥哥有类似症状。

1.2方法

所有患者均采用对症支持治疗，少数患者使用糖皮质激素治疗。收集所有患者的病历资料，采用MLPA技术对DMD基因79个外显子缺失/重复突变进行筛查。

2　结果

2.1病历资料

52例患者均为慢性隐匿起病；发病症状为肢体无力、走路姿势异常42例，意外发现肌酸激酶（creatine kinase，CK）显著升高8例，出生后运动发育落后就诊2例；肌力5级16例，4级20例，3级14例，2级2例；Gower's症阳性40例，多表现为四肢近端为主的肌力减退，随着病情进展，大部分患者四肢近端肌群伴有不同程度萎缩（伴肌肉萎缩6例），大部分可见腓肠肌假性肥大（仅3例无肥大），伴肌痛或肌肉压痛3例；伴轻度智能减退8例，伴心慌、心悸9例；CK最高27 167U/L，平均（12 097.3±8 112.19）U/L；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH） 最高 1 835U/L，平均（990.2±469.94）U/L；行肌红蛋白检测3例，均大于1 200 μg/L；心电图检查16例，异常7例（43.75%），其中窦性心动过速2例，窦性心律不齐4例，不完全性右束支传导阻滞1例；超声心动图检查15例，异常5例，提示左心室增大5例，室间隔与左心室壁增厚3例，右心室肥厚2例。

2.2基因检测结果

52例患者中，基因检测未见异常4例（7.69%），DMD基因缺失40例（76.9%），重复8例（15.3%）。基因突变发生在外显子45～55 22例（40.74%），2～19区域10例（19.23%）。26例患者父母进行检测，所有患者父亲基因均未见异常，患者母亲基因存在异常16例。48例基因异常患者中，符合阅读框架原则42例（87.5%）。8例伴智力下降患者的基因型：46～50外显子重复，51～60外显子区域重复，59～60外显子缺失，45～57外显子重复，45～48外显子缺失，46～50外显子缺失，51～54外显子缺失，48～50缺失（图1）。7例伴心慌胸闷症状/伴心电图异常/心脏彩超异常患者的基因型：3～11号外显子缺失，3号外显子缺失，4号外显子缺失，3～12外显子缺失，2号外显子缺失，45～47外显子缺失，45～48外显子缺失（图2）。

图1　伴智力障碍患者的基因异常位点分布

图2　伴心脏损害患者的基因异常位点分布

3　讨论

本研究中患者均采用MLPA，该技术使用一对通用引物对DMD基因79个外显子缺失/重复突变进行筛查，能检测外显子大片段缺失/重复突变，同时也可检测杂合缺失/重复突变。本研究MLPA检测结果示缺失40例（76.9%），重复8例（15.3%），未见异常4例（7.69%），与文献报道（缺失65%，重复6%～10%）[6]大致相符。所有的突变和缺失可发生在基因的任何位置，但是有两个缺失的热点区域：一个位于基因的中央区，外显子45～55，另一个位于5'端，包括外显子2～19。本研究中32例患者缺失位于这两个区域，其中位于外显子45～55之间22例，位于外显子2～19区域10例，与文献相符[7]。

本研究中，一例患者有44号外显子的一个位点的缺失，但临床症状重，双下肢肌力2～3级，腓肠肌肥大。另一患者表现为9～29号外显子多个位点缺失，临床症状轻，双下肢肌力4级，腓肠肌轻度肥大。患者的临床症状轻重不一，患者的临床症状与基因缺失的大小似乎并不平行。文献提到，外显子44缺失的患者，可表现为典型的DMD症状，而一些将近50%的基因缺失患者，临床却表现为贝氏肌营养不良症（Becker muscular dystrophy，BMD）[7]。有研究提到，患者的外显子32～44、48～51、48～53缺失，但可表现为正常或接近正常的肌酶[8]。可能患者基因缺失的大小与临床症状的关系不大，病情严重程度关键取决于突变是否会破坏阅读框结构[7]。Monaco等[9]提出“阅读框规则”，认为保留阅读框的突变通常可产生有部分功能的抗肌萎缩蛋白。如果破坏了阅读框规则，框外突变可提前终止密码，产生极不稳定的mRNA后通常被迅速降解，抗肌萎缩蛋白明显减少或缺失，在细胞中迅速降解不能发挥功能。所以影响基因开放阅读框的突变会导致发病早、症状较重的DMD；若为框内缺失，相连接的外显子仍能维持mRNA的阅读框架，产生有部分功能的抗肌萎缩蛋白，可表现为临床症状较轻的BMD[10]。

本研究中有8例患者表现为智力下降，所有患者的缺失位点均靠近3’端。很多研究中发现患者的智力与基因突变位置及蛋白各亚型存在密切联系。DMD的基因由79个外显子和78个内含子构成，含有7个内部启动子。这些启动子启动形成不同的蛋白亚型（图3）[11]。位于5’端的基因（1～31）启动形成3个最长的亚型Dp427M、Dp427C、Dp427P，这些都可表达于骨骼肌和心肌细胞、皮质的神经元、小脑浦肯野细胞。分别以DMD基因第30、45、56和63号外显子作为第一个外显子启动转录，其产物分别为260 kU（Dp260）、140 kU （Dp140）、116 kU（Dp116）和71 kuU（Dp71）[12]。Dp260在视网膜中高表达，Dp140主要表达于脑、肾组织，Dp116在雪旺细胞中表达，Dp71在包括脑、视网膜、肾、肝、肺等多种组织器官中表达[7]。在Bresolin研究中发现，DP140表达异常的患者的智力比其他亚型的患者的智力损害更为明显[13]，而DP140是由第45号外显子作为第一个外显子的启动转录。另有研究认为3’端（63号外显子）的变异对于智力的影响更为严重，而这个位置是转录DP71的。患者有以上位点的突变时，影响了任何可表达于颅内的亚型的存在，都可表现出神经发育迟滞[2]。DMD基因第45号外显子后尤其是第63号外显子后基因缺陷易导致智力障碍，基因突变越接近5’端对智力的影响越轻，越接近3’端对智力的影响越重[12]。

文献中提到DMD患者的心电图异常主要为心律不齐，心房异位搏动、室性早搏[14]，心脏彩超异常表现为左心房和左心室扩大、瓣膜相对关闭不全、射血分数降低等[15]，本研究中患者的异常与文献相符。Jefferies 等[16]观察69例DMD患者，发现第12和14～17号外显子与患者心肌损害具有相关性，认为基因越接近5'端，心脏损害程度越严重。Arbustini等[17]报道，在201例心脏损害的DMD患者中，6.5%患者的DMD基因异常位点位于外显子45～55之内。目前心脏损害的演变规律及其与基因型的关系尚未阐明，有待进一步的研究。

本研究确诊的DMD患者中，符合阅读框架原则42例（87.5%）。如前文中提到，影响基因开放阅读框的突变会导致发病早、症状较重的DMD；若为框内缺失，不影响阅读框架，相连接的外显子可产生有部分功能的抗肌萎缩蛋白，临床表现相对较轻，表现为BMD。在本研究中，少数患者虽然基因缺失并没有改变基因的阅读框架，但仍表现为临床症状相对较重的DMD，因此其可能的机制为：在内含子中部分序列的改变激活潜在的剪接增强子，虽不影响蛋白的分离，但改变mRNA的剪接方式，导致表型与基因型不符[7]。

DMD患者缺乏特异性的治疗方法，本研究中的病例多给予对症支持治疗，少数患者使用糖皮质激素治疗，但是疗效一般，在现阶段的基因治疗研究方向包括：干细胞移植、病毒载体及非病毒载体实现，外显子跳跃，终止密码子通读[18]等。DMD的基因庞大，需要对于DMD基因有更多更详细的了解，为DMD的诊断和基因治疗提供方向。

图3　[11]DMD基因的基因结构

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（本文编辑：王晶）

The Association between Clinical Manifestations of Duchenne Muscular Dystrophy and Gene Expression

JI Su-qiong,LI Yue,WANG Qiong,BU Bi-tao.Department of Neurology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China

Objective:To analyze gene mutations in the dystrophin gene in Duchenne muscular dystrophy(DMD) patients and the correlation between the genotypes and clinical presentation.Methods:The clinical phenotuypes and gene mutations of 52 DMD patients were retrospective analysed.Results:The main clinical features of the patients were the proximal muscle weakness and atrophy,unusual walking posture,and stunted growth.In addition, some patients were accompanied with mental decline and heart function impairment.Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification(MLPA)was used to detect the gene mutations.The exons deletion was detected in 40 cases (76.9%),the exons dupulition in 8 cases(15.3%),no mutations in 4 cases(7.69%).There were 22 cases(40.74%) gene mutation in exons 45 to 55,and 10 cases(19.23%)gene mutation in exons 2～19.In the 48 patients with detected mutatins,there were 42 patients(87.5%)were conformed to the principle of reading frame.Conclusion: The serious clinical symptoms do not depend on the size of the gene mutations,but on whether mutations destroy the reading frame structure.Gene mutations closer to the 5'end of the gene have lighter influence in intelligence, and those closer to the 3'end of the gene have much heavier impact on intelligence.

Duchenne muscular dystrophy;Duchenne muscular dystrophy gene;multiplex ligation-dependent probe amplification;gene deletion;gene duplication

·论著·

R741;R746.2

A

10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.01.009

华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科

武汉430030

2015-06-13

卜碧涛

bubitao@tjh.tjmu. edu.cn