紫草素对乳腺癌MCF-7细胞雌激素受体的表达和增殖及凋亡的影响

陈玉忠， 韩福生， 许　磊， 张智瑞， 潘　琼， 刘　浩， 金功圣*

(1蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科，蚌埠　233000； 2蚌埠医学院药学系； *通讯作者，E-mail:jgs2007@qq.com)



紫草素对乳腺癌MCF-7细胞雌激素受体的表达和增殖及凋亡的影响

陈玉忠1， 韩福生1， 许磊1， 张智瑞2， 潘琼2， 刘浩2， 金功圣1*

(1蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科，蚌埠233000；2蚌埠医学院药学系；*通讯作者，E-mail:jgs2007@qq.com)

目的探讨紫草素(shikonin，SK)对乳腺癌MCF-7细胞雌激素受体表达及其对细胞的增殖和凋亡的影响。方法用MTT法检测不同浓度SK(0，1，2，4，8 μmol/L)处理MCF-7细胞24，48，72 h的增殖抑制作用；集落克隆形成实验观察低浓度SK(0，0.1，0.2，0.4 μmol/L)对MCF-7细胞增殖的影响；DAPI染色观察SK处理24 h对MCF-7细胞凋亡的影响；流式细胞术(PI单染法)检测不同浓度SK(0，1，2，4，8 μmol/L)作用MCF-7细胞24 h细胞凋亡比率；Western blot法检测SK对雌激素受体表达的影响。结果SK作用于MCF-7后细胞存活率随浓度增加而降低(P<0.05)。0.1，0.2，0.4 μmol/L SK作用MCF-7细胞后抑制集落克隆形成，0.1，0.2，0.4 μmol/L SK组分别与对照组相比，差异均具有统计学意义(P<0.05)。DAPI荧光染色结果显示，随SK浓度(1，2，4，8 μmol/L)增加，浓缩深染致密状的细胞核数目逐渐增加。不同浓度的SK(1，2，4，8 μmol/L)作用于MCF-7细胞凋亡率分别为(7.0±1.27)%，(11.6±1.45)%，(15.1 ±1.36)%，(29.5±1.41)%，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。MCF-7细胞株中雌激素受体的表达随SK浓度的增加而降低；2，4 μmol/L组与对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论SK可抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖，并诱导其凋亡，其机制可能与雌激素受体表达降低有关。

紫草素；乳腺癌;MCF-7细胞；增殖；凋亡；雌激素受体

乳腺癌是女性高发的恶性肿瘤，同时是引起女性肿瘤相关死亡的首要原因[1]。其中死于雌激素受体(ER)阳性的乳腺癌患者明显高于HER2阳性及三阴性乳腺癌患者[2]。雌激素及雌激素受体在乳腺癌的发生发展中起到关键性作用。因此，针对ER的靶向治疗药物如他莫昔芬、氟维司群等已在ER阳性乳腺癌患者中应用[3]，而乳腺癌内分治疗过程中耐药[4]的产生，不得不寻求其他可能有效的治疗手段。紫草作为一种抗炎、抗肿瘤药物，在我国传统医学中应用广泛，紫草素(shikonin, SK)可从紫草科植物中提取。有报道称其可对多种肿瘤细胞株产生作用。本研究以ER阳性乳腺癌MCF-7细胞株为研究对象，探讨SK对MCF-7细胞的增殖、凋亡及其对雌激素受体表达的影响，以期为乳腺癌治疗提供一些思路。

1　材料与方法

1.1主要试剂与仪器

人乳腺癌MCF-7细胞购于中国科学院上海细胞库。SK、MTT购于Sigma公司(美国)，二甲亚砜(DMSO)(Biosharp公司，美国)，DMEM培养基粉末、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)购于Gibco公司(美国)，碘化丙啶(propidium iodide，PI)购于Sigma公司(中国)。兔抗ER抗体购于Proteintech公司(美国)，鼠抗β-actin抗体购于Biosharp公司(中国)，山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG购于Santa Cruz Biotechnology公司(美国)。

恒温CO2培养箱(Themo公司，美国)，Bio Tek酶标仪(Synergy HT公司，美国)，Accuri C6流式细胞仪(Becton Dicknson公司，美国)，IX73倒置荧光显微镜(Olympus公司，日本)。ChemDoc XRS凝胶成像系统(Bio-Rad公司，美国)。

1.2细胞培养

用含10% FBS、10 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM培养基培养MCF-7细胞，37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

1.3MTT法检测细胞存活率

MCF-7细胞以6 000个/孔接种于96孔板中放入培养箱，培养24 h细胞贴壁后分别加入不同浓度的SK(0，1，2，4，8 μmol/L)，每组4个复孔，放入培养箱中继续培养。加入药物24，48，72 h再加入15 μl MTT(5 mg/ml溶于PBS中)，放入CO2培养箱孵育4 h，吸出96孔板内液体并加入150 μl DMSO，用酶标仪在490 nm处检测每孔的吸光度。

1.4集落克隆形成实验检测SK对MCF-7细胞克隆形成的抑制作用

6孔板每孔接种5 500个细胞，放入培养箱培养24 h，分别加入0，0.1，0.2，0.4 μmol/L的SK，培养5 d集落形成，除去培养液，用PBS洗2次，用5%多聚甲醛固定后弃去多聚甲醛，加5%结晶紫染色并在室温孵育10 min回收结晶紫，用双蒸水清洗2次。室温干燥，观察药物作用后集落形成情况，以此反应药物对MCF-7细胞的增殖抑制作用。100倍显微镜下每组选取5个视野，统计集落个数(每个集落至少包含50个细胞)，进行统计分析。

1.5DAPI染色法检测SK对MCF-7凋亡的影响

以1.2×105细胞/孔接种于12孔板，培养24 h分别予每孔加入不同浓度SK(1，2，4，8 μmol/L)，给药24 h吸尽培养液，加0.5 ml多聚甲醛固定10 min，去除固定液后用PBS洗2遍，3 min/次，避光条件下，加入DAPI染色30 min，用荧光显微镜观察细胞核的形态学变化。

1.6PI单染法检测SK作用后细胞的凋亡

12孔板中每孔接种1.4×105个细胞，放入培养箱培养24 h，分别加入不同浓度的SK(0，1，2，4，8 μmol/L)，继续培养24 h，收取细胞行PI染色用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7Western blot法检测紫草素作用后雌激素受体的表达

应用不同浓度的SK(1，2，4，8 μmol/L)作用于MCF-7细胞24 h，收取细胞，并用RIPA蛋白裂解缓冲液在冰上裂解30 min，置入4 ℃离心机12 000 r/min离心30 min，提取上清进行蛋白定量后，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束将蛋白条带转至PVDF膜，蛋白封闭，分别孵育一抗、二抗并进行曝光。使用Image J 软件对蛋白条带灰度值进行扫描，并做统计分析。

1.8统计学分析

2　结果

2.1SK对MCF-7细胞的增殖抑制作用

MTT法检测不同浓度SK(0，1，2，4，8 μmol/L)作用MCF-7细胞株24，48，72 h，MCF-7细胞的增殖明显被抑制，随着SK浓度的增加和作用时间的延长，药物对细胞增殖抑制的作用增强(见图1)，1，2，4，8 μmol/L SK作用相同分别与对照组(0 μmol/L SK)相比，差异有统计学意义。相同浓度SK作用后分别与前一时段比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2SK对MCF-7细胞克隆形成的抑制作用

分别用0，0.1，0.2，0.4 μmol/L的SK处理MCF-7细胞5 d，与对照组相比MCF-7细胞株中雌激素受体的表达随SK浓度的增加而降低，药物作用组的细胞集落克隆数逐渐减少(见图2A)。100倍视野下统计形成集落数，各组分别与对照组比较，差异均具有统计学意义(见图2B)。

与对照组(0 μmol/L)相比，*P<0.05；与24 h比较，#P<0.05；与48 h相比，P<0.05图1　SK对MCF-7细胞存活率的影响Figure 1　The effect of SK on cell viability in MCF-7 cells treated with SK

2.3DAPI染色检测SK对MCF-7凋亡的作用

在分别使用1，2，4，8 μmol/L SK作用24 h，DAPI染色检测SK作用细胞后细胞核的变化，结果显示，随着药物浓度的增加，与对照组相比，细胞密度逐渐降低，细胞核呈现出浓染致密的固缩形态及颗粒状荧光，随着SK浓度增加，浓缩深染致密状的细胞核数目也逐渐增加(见图3，红色箭头所示)。

2.4PI染色检测SK对MCF-7细胞凋亡的影响

在不同浓度SK作用于乳腺癌MCF-7细胞株24 h，流式细胞术检测结果显示，随着给药浓度的增加，细胞凋亡率逐渐增加，与对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05，见图4)。

图2　SK对MCF-7细胞增殖的抑制作用Figure 2　Inhibition of SK on colony formation of MCF-SK 7 cells

图3　SK对MCF-7细胞凋亡的影响Figure 3　The effect of SK on apoptosis of MCF-7 cells

2.5SK对MCF-7细胞株雌激素受体表达的影响

Western blot 条带结果显示，SK作用于MCF-7细胞后ER的表达降低(见图5A)。测定灰度值并计算出分别应用1，2，4 μmol/L SK后，MCF-7细胞中ER的相对表达量分别是1.71±0.205,1.12±0.097,0.92±0.160,0.56±0.147(见图5B);ER抑制率分别是为(34.38±5)%、(44.24±15)%、(65.64±12)%。与对照组相比，应用2 μmol/L及4 μmol/L SK组，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01，见图5B)。

图4　SK对MCF-7细胞凋亡的作用Figure 4　The apoptosis induced by SK in MCF-7 cells

图5　SK作用于MCF-7细胞24 h雌激素受体的表达Figure 5　Expression of estrogen receptor in MCF-7 cells after treated by SK for 24 h

3　讨论

中药紫草提取物SK及其衍生物可通过Bax/Bcl-XL，MAPK，HIF-1，TRAP1，Nur77/Bcl-2，NF-κB以及ROS的参与介导细胞凋亡，并且可以引起肿瘤细胞坏死，抑制肿瘤转移，抗血管增生等[5]。并且，SK可诱导多种肿瘤细胞株凋亡，如人早幼粒细胞白血病HL60细胞株[6]、人肝癌细胞株Hep-1细胞[7]、人恶性黑色素瘤细胞株A375-S2[8]、人结肠癌细胞[9]及宫颈癌细胞株[10]的凋亡，并且明显抑制乳腺癌细胞增殖以及促进细胞凋亡[11,12]。文献报道SK联合他莫昔芬(tamoxifen，TAM)对乳腺癌细胞株有明显抑制作用[11]。

在对乳腺癌药物干预的探究中，SOFT和TEXT临床实验表明，降低机体内雌激素的作用有助于改善患者的生存状况[13]，然而一部分病人在内分泌治疗中产生耐药[4]，SK的抗肿瘤作用可能与乳腺癌内分泌治疗耐药存在共同的作用分子[14,15]。

在Yao等进行的研究中，SK联合TAM对MCF-7细胞存活率的抑制较单药应用效果明显增强[11]。本研究应用SK作用于ER阳性乳腺癌细胞MCF-7后，细胞增殖明显被抑制，并且随着给药浓度的增加，细胞凋亡比例也逐渐增加。Western blot法中检测到随着SK浓度的增加，蛋白条带显示ER表达降低。在动物实验中SK抑制肿瘤的情况较好，但在应用之后出现了体重减轻等副作用[16]。虽然SK联合TAM对MCF-7细胞株的作用强于单药[11]，但考虑到SK副作用带来的不良影响[16]，应用时或许需要降低SK剂量，本研究中较低浓度的SK对MCF-7细胞株的增殖抑制及凋亡作用不明显；本研究中SK可以降低ER表达，ER是TAM作用靶点，在低剂量SK联合TAM进行治疗时，可能会因为SK剂量低而使其抗肿瘤作用不明显，SK又可降低ER表达而使TAM不能充分发挥作用。然而，本研究的不足之处在于，未在分子水平上进行针对ER的干扰或过表达等实验。随后可以进行动物体内实验来探究SK的抗肿瘤效果及抗肿瘤机制。

以上研究结果提示，SK可以抑制乳腺癌MCF-7的增殖并诱导其凋亡，其机制可能与降低ER的表达有关。本研究为中药提取物SK用于治疗乳腺癌提供了一些思路和理论支持。

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Effects of shikonin on proliferation, apoptosis and expression of estrogen receptor in breast cancer MCF-7 cells

CHEN Yuzhong1, HAN Fusheng1, XU Lei1, ZHANG Zhirui2, PAN Qiong2, LIU Hao2, JIN Gongsheng1*

(1DepartmentofSurgicalOncology,FirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233000,China;2FacultyofPharmacy,BengbuMedicalCollege;*Correspondingauthor,E-mail:jgs2007@qq.com)

ObjectiveTo investigate the effect of shikonin(SK) on the expression of estrogen receptor(ER) and the proliferation and apoptosis in breast cancer cell line MCF-7.MethodsMCF-7 cells were exposed to different concentrations(0,1,2,4,8 μmol/L) of SK for 24, 48 and 72 h and the cell viability was assessed with MTT assay. The nuclear changes in MCF-7 cells treated with SK were observed under fluorescent microscope. The apoptotic cell after treated with 0,1,2,4,8 μmol/L SK for 24 h was quantified by flow cytometry. Colony formation assay was used to detect the proliferation of MCF-7 cells after treated with SK.Western blot was used to detect the expression of ER in MCF-7 cells after SK treatment.ResultsThe cell viability of MCF-7 cells decreased in a concentration-dependent manner after treated with SK(P<0.05). Low levels(0.1,0.2,0.4 μmol/L) of SK inhibited cell colony formation,and the number of colony formation of MCF-7 cells was significantly decreased in 0.1，0.2，0.4 μmol/L SK groups compared with control group(P<0.05). DAPI staining showed that MCF-7 cell nucleus became condensed and deep-stained gradually after treated with 1,2,4,8 μmol/L SK. The apoptotic rate was(7.0±1.27)%,(11.6±1.45)%, (15.1±1.36)% and (29.5±1.41)% in MCF-7 cells treated with 1,2,4,8 μmol/L SK, respectively, which was significantly higher than in control group(P<0.05). The expression of ER in MCF-7 cells treated with SK was decreased, and a significant difference was detected in MCF-7 cells exposed to 2, 4 μmol/L SK compared with control group(P<0.05).ConclusionSK could inhibit the proliferation and induce the apoptosis in MCF-7 cells, which may be related to down-regulation of the expression of estrogen receptor.

shikonin;breast cancer;MCF-7;proliferation;apoptosis;estrogen receptor

国家自然科学基金资助项目( 81372899)；安徽省自然科学基金资助项目(1508085MH166)

陈玉忠，男，1990-02生，硕士，E-mail：cyz0903@foxmail.com

2016-06-08

R737.9

A

1007-6611(2016)08-0724-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.011