表皮生长因子受体对乙醇所致肝细胞损伤中脂肪酸合酶表达的影响

赵　刚， 董　蕾， 李　红， 史海涛， 秦　斌， 赵红莉， 鲁晓岚

(西安交通大学第二附属医院消化内科，西安　710004； *通讯作者，E-mail: dong556@126.com)



表皮生长因子受体对乙醇所致肝细胞损伤中脂肪酸合酶表达的影响

赵刚， 董蕾*， 李红， 史海涛， 秦斌， 赵红莉， 鲁晓岚

(西安交通大学第二附属医院消化内科，西安710004；*通讯作者，E-mail: dong556@126.com)

目的观察乙醇所致原代培养小鼠肝细胞损伤中脂肪酸合酶(FASN)的表达情况，探讨表皮生长因子受体(EGFR)在此过程中可能的作用。方法常规原代培养小鼠肝细胞，随机分为对照组(生理盐水组)、乙醇组、Gefitinib组及Gefitinib加乙醇组，收集并测定细胞裂解液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性和丙二醛(MDA)浓度；提取细胞总RNA及蛋白质，分别采用real time-PCR及Western blot方法检测FASN、固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding proteins,SREBP-1c)及p-EGFR的基因及蛋白的表达。结果经150 mmol/L乙醇作用10 h的小鼠原代培养肝细胞贴壁生长状况变差，与对照组比较，细胞裂解液中ALT、AST活性及MDA浓度显著上升(P<0.01)，出现肝细胞损伤。与对照组比较，Gefitinib组肝细胞的FASN、SREBP-1c及EGFR在基因及蛋白水平均无明显变化(P>0.05)，乙醇组肝细胞的FASN、SREBP-1c及p-EGFR在基因及蛋白水平表达丰度均明显升高，其差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与乙醇组比较，Gefitinib加乙醇组肝细胞中FASN及SREBP-1c的基因及蛋白表达水平显著降低(P<0.01)，其p-EGFR mRNA的表达量仍处于高值，但差异无统计学意义(P>0.05)，而其蛋白表达水平出现显著下降(P<0.05)。结论FASN在正常肝细胞中仅微量表达，而在乙醇所致肝损害的肝细胞中呈高表达，其表达水平可能受EGFR调节。

表皮生长因子受体；酒精性肝损害；脂肪酸合酶；酪氨酸激酶抑制剂

在我国，酒精是继病毒性肝炎之后对人体肝脏构成巨大威胁的最重要病因，由于过量酒精摄入所导致的慢性肝病的发病率正呈逐年上升趋势，酒精滥用及依赖已然成为危害人民健康的公共卫生问题[1]。流行病学资料显示[2]重度饮酒者中80%以上可出现不同程度的脂肪肝，10%-35%可发展成酒精性肝炎，10%-20%可发展至肝硬化阶段，因此，酒精性肝病的防治已成为重要的医疗及公共卫生课题。脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FASN)是促进内源性长链脂肪酸合成的关键酶，其位于细胞浆内，并主要分布于高脂肪代谢及对激素敏感的组织中，肝脏即为代表性脏器[3]。由于正常机体主要依靠糖类物质供能，因此哺乳动物肝细胞中FASN表达量较低[4]。当机体处于某种特殊状况，如急性应激、炎症甚至癌变时[5]，肝脏的脂质代谢水平会明显升高，以适应内外环境的变化，此时组织及细胞中FASN表达量会有不同程度的变化[6]。表皮生长因子受体及其与相关配体结合后所激活的细胞内信号转导通路是目前肿瘤学研究的热点，该信号通路可启动细胞核内有关基因，从而促进细胞的分裂与增殖[7]。Gefitinib是一种选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，可选择性的结合细胞膜内的酪氨酸激酶区域，阻断酪氨酸激酶与ATP的结合，进而阻断EGFR信号通路向下游传导，临床上被用于治疗局部晚期或远处转移的非小细胞肺癌[8]。本实验以体外培养原代小鼠肝细胞为研究对象，探讨乙醇所致肝细胞急性损伤模型中，FASN的表达变化情况及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)可能的调节机制。

1　材料与方法

1.1小鼠及主要试剂与仪器

3-5周龄BALB/c小鼠(SPF级，生产许可证号：SCXK(陕)2012-003)由西安交通大学实验动物中心提供。DMEM培养基购自美国GIBCO公司；胎牛血清为北京元亨生物工程有限公司产品；胰蛋白酶、TRIzol、二甲基亚砜(DMSO)及细胞裂解液购自美国Sigma公司；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)及丙二醛(MDA)检测试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供；Quant One Step qRT-PCR Kit(Probe)试剂盒为北京天根生化科技有限公司产品；PCR引物由上海英骏生物科技有限公司合成。Western blot用HRP化学发光底物为美国Millipore公司产品，β-actin单克隆抗体及其余免疫印迹所需试剂均由北京华肽先锋生物科技公司提供。OPTICONTM荧光定量PCR检测系统及Gel DOC型全自动凝胶成像分析系统均为美国Bio-Rad公司产品。所用Gefitinib由扬州大学胡本顺博士惠赠。

1.2肝细胞原代培养

根据文献[9]方法将BALB/c小鼠麻醉后断头处死，无菌分离肝组织后剔除包膜及纤维成分，加入预先配置好的消化液(主要成分为胰酶)置4 ℃冰箱过夜消化；去除消化液并加入含10%胎牛血清的DMEM培养液制成肝细胞悬液，再经200目尼龙筛网过滤并离心收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%，按5×105/ml密度接种，于37 ℃、5%CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为5%胎牛血清DMEM培养液继续培养。

1.3动物分组与处理

60只BALB/c小鼠随机分为4组:对照组(生理盐水组)、乙醇组(150 mmol/L)、Gefitinib组(1 μmol/L)及Gefitinib加乙醇组，每组各15只。按照前述肝细胞原代培养方法进行动物的麻醉后处死及肝细胞分离培养，培养至第7天更换培养液时分别给予相应处理措施，继续培养细胞10 h收集细胞进行裂解并收集裂解液留存或提取细胞总RNA及蛋白质留存待检。

1.4生化指标测定

将收集到的各组细胞加入裂解液吹打(约100 μl裂解液/200万细胞)，裂解2 min，10 000 r/min离心10 min，收集裂解液并除去细胞，留取上清液待检。按照检测试剂盒说明书分别检测ALT和AST在上清液中的活性，单位为IU/L。用Lowry法测定细胞内总蛋白含量，再按照硫代巴比妥法检测上清液中MDA含量，单位用μmol/g蛋白表示。

1.5real time PCR法检测FASN、SREBP-1c及p-EGFR基因表达

收集细胞后用TRIzol试剂提取细胞内的总RNA，按照Quant One Step qRT-PCR Kit (Probe)试剂盒说明配置qRT-PCR反应液。qRT-PCR步骤为：50 ℃反转录30 min，92 ℃起始模板变性3 min，后开始PCR循环，92 ℃变性10 s，55 ℃退火20 s，68 ℃延伸20 s，共42个循环。PCR反应结束后计算机自动绘制标准曲线，扩增曲线及溶解曲线等。

1.6Western blot法检测FASN、SREBP-1c及p-EGFR蛋白表达

利用Bradford比色法测定前期提取的原代肝细胞总蛋白浓度，取30 μg蛋白样品并加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，之后对蛋白样品进行电泳分离及电转至PVDF膜；以100 g/L脱脂牛奶对PVDF膜进行封闭过夜；分别加入羊抗鼠FASN、SREBP-1c及p-EGFR抗体(1∶500)作为一抗室温孵育PVDF膜1 h；以冲洗缓冲液洗膜3次，每次10 min；加入辣根过氧化物酶偶联的牛抗羊IgG(1∶5 000)二抗孵育1 h；再次以冲洗缓冲液洗膜3次，每次10 min；以ECL发光试剂盒曝光显影；β-actin作为内参照。

1.7统计学分析

2　结果

2.1原代培养肝细胞生长状况

原代培养小鼠肝细胞约48 h可见大部分细胞贴壁生长，光镜下肝细胞呈三角形或梭形，排列整齐，细胞界限清晰，胞质丰富透亮。细胞核有单核、双核，呈圆形或椭圆形，核仁清晰可见。经150 mmol/L乙醇作用10 h的原代肝细胞贴壁状况明显变差，圆形或类圆形细胞比例增多，其余各组肝细胞光镜下形态改变不明显。

2.2细胞培养裂解液中ALT、AST活性及MDA浓度

与对照组比较,经150 mmol/L乙醇作用10 h细胞裂解液中ALT及AST活性明显升高，MDA浓度亦显著上升(P<0.01，见表1)，提示肝细胞损伤。与乙醇组比较，Gefitinib加乙醇组肝细胞裂解液中ALT与AST活性出现显著下降，MDA浓度亦明显降低(P<0.05，见表1)，提示Gefitinib对乙醇所致肝细胞损伤具有保护作用。

表1各组细胞裂解液中ALT与AST活性、MDA浓度

Table 1Comparison of ALT, AST and MDA in cell lysates among four groups

组别ALT(IU/L)AST(IU/L)MDA(μmol/g蛋白)对照组74.13±10.3286.04±13.1417.62±1.43乙醇组213.10±19.33**198.15±22.35**52.31±2.60**Gefitinib组85.34±12.2292.03±15.2419.52±1.74Gefitinib+乙醇组101.11±16.20#106.08±17.22#24.82±2.24#

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与乙醇组比较，#P<0.05

2.3FASN、SREBP-1c及p-EGFR基因的表达水平

与对照组比较，原代培养小鼠肝细胞在经乙醇作用后其FASN、SREBP-1c及p-EGFR基因表达水平明显升高(P<0.01，见图1)。而Gefitinib加乙醇组肝细胞FASN及SREBP-1c基因表达水平与对照组比较无明显差异(P>0.05)。Gefitinib加乙醇组的p-EGFR基因表达水平类似于乙醇组，均显著高于对照组(P<0.01，见图1)。

2.4FASN、SREBP-1c及p-EGFR蛋白的表达水平FASN、SREBP-1c及p-EGFR蛋白表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01，见图2)，而Gefitinib加乙醇组肝细胞中SREBP-1c和p-EGFR蛋白表达水平与对照组比较无明显差异。与对照组及Gefitinib组比较，Gefitinib加乙醇组的FASN蛋白表达量明显升高(P<0.05)，但显著低于乙醇组(P<0.01，见图2)。

与对照组比较，乙醇组原代培养小鼠肝细胞的

与对照组比较，**P<0.01；与乙醇组比较，##P<0.01图1　FASN、SREBP-1c及p-EGFR基因的表达水平Figure 1　Gene expression of FASN, SREBP-1c and p-EGFR in four groups

图2　FASN、SREBP-1c及p-EGFR蛋白的表达水平Figure 2　Protein expression of FASN,SREBP-1c and p-EGFR in four groups

3　讨论

不同病因所导致的肝脏炎性改变是各种慢性肝病发生发展的共同基础，其受到外界侵袭因素或内在循环紊乱、代谢障碍及免疫反应等多重因素的影响[10]。既往研究表明，多种细胞因子，如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-10(Interleukin-10, IL-10)、胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor-1, IGF-1)、热休克蛋白(heat shock protein, HSP)及一氧化氮(nitric oxide, NO)等在肝细胞致炎与抗炎平衡体系中扮演着不同的角色，同时此类细胞因子可能与肝细胞能量代谢相关联，通过能量代谢调节细胞增生、变性、凋亡及癌变等病理生理过程[11-15]。

FASN是哺乳动物机体内催化内源性长链脂肪酸合成的关键酶。在正常生理状况下，哺乳动物机体组织优先利用来自食物中摄取的脂质，内源性脂肪酸合成处于较低水平，因此在正常组织及细胞中FASN不表达或微量表达。本课题组既往的相关实验表明[5]，体外培养的肝癌细胞HepG2可显著高表达FASN，而通过抑制FASN表达可达到促进肿瘤细胞凋亡的效果，这些发现与近年来多项其他研究认为的FASN在多种肿瘤组织中异常升高，且其升高水平与恶性肿瘤患者的预后呈负相关的结论相一致[16-18]。FASN在肿瘤性病变发生发展过程中的异常改变得到了学者们的广泛关注与重视，但在非肿瘤性病变，尤其是在酒精性肝病方面鲜有报道。固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBPs)是调控与脂质代谢相关基因表达的关键性核转录因子，包括三种亚型，其中SREBP-1c是肝脏脂质代谢的关键调控者。本研究发现，经乙醇作用后肝细胞中SREBP-1c表达明显升高，同时FASN表达亦显著升高，提示乙醇所致肝细胞损害中SREBP-1c发挥了对FASN基因转录与表达的调节作用。

有研究发现，SREBP-1c和FASN与EGFR关系密切。EGFR广泛存在于哺乳动物的上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞等细胞表面，可分为胞外配体结合区、跨膜区和胞内激酶区。EGFR可通过与表皮生长因子(EGF)或转化生长因子α(TGF-α)等配体结合而二聚体化，使其中的蛋白酪氨酸激酶活性增强，受体自身的酪氨酸残基发生磷酸化，这种自磷酸化是细胞内信号转导的重要基础，可激活SREBP-1c的转录，进一步促进由SREBP-1c介导的FASN启动子活化，从而增加FASN的表达。本研究发现，经乙醇作用后肝细胞中磷酸化EGFR(p-EGFR)与SREBP-1c和FASN的基因表达水平同步显著升高，提示在乙醇所致肝细胞损害中EGFR参与了SREBP-1c对FASN基因转录及表达的调控作用；研究同时发现，与乙醇组比较，Gefitinib加乙醇组中p-EGFR的基因表达水平无明显变化，但p-EGFR的蛋白表达水平有显著降低，提示转录后调节在此可能发挥了重要作用。

原发性肝细胞癌的发生机制尚不明确，目前认为它可能是多因素、多步骤共同作用的结果。现有研究尚无确认酒精为致癌剂的确切证据，酒精在肝癌发生过程中可能主要起辅助因子的作用。本研究中，原代小鼠肝细胞经150 mmol/L乙醇作用10 h，细胞基本形态未出现明显变化，但其贴壁生长状况变差，同时细胞裂解液中ALT、AST活性及MDA浓度均出现显著升高，提示肝细胞损害，而进一步检测细胞中FASN及SREBP-1c在基因及蛋白水平表达状况可证实，经乙醇作用后的肝细胞为确保自身生长需要，已充分调动内源性脂肪酸合成能力，此种细胞生物学反应有肿瘤细胞代谢的部分生物化学特性，值得进一步深入研究。

综上所述，本研究发现，在乙醇所致肝细胞损害中SREBP-1c发挥了对FASN基因过表达的调控作用，而EGFR在此过程可能扮演了重要的角色。但Gefitinib对乙醇所致肝细胞损伤具体的保护作用机制，以及EGFR信号通路在此过程中具体的调控作用机制仍需要深入系统的研究。

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Effects of epidermal growth factor receptor on fatty acid synthase expression in ethanol-induced liver injury

ZHAO Gang, DONG Lei*, LI Hong, SHI Haitao, QIN Bin, ZHAO Hongli, LU Xiaolan

(DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China；*Correspondingauthor,E-mail:dong556@126.com)

ObjectiveTo investigate the expression of fatty acid synthase(FASN) in ethanol-induced liver injury in primary mouse hepatocytes, and to explore the possible role of epidermal growth factor receptor(EGFR) in the process of liver injury.MethodsPrimary mouse hepatocytes were cultured conventionally,and randomly divided into normal control group(saline group), ethanol group, Gefitinib group, and Gefitinib plus ethanol group. Malondialdehyde(MDA) concentrations and activities of alanine aminotransferase(ALT) and aspartate aminotransferase(AST) were detected in cell lysates. Total RNA and protein from liver cells were extracted to measure the mRNA and protein expression of FASN, sterol regulatory element binding proteins(SREBP-1c) and EGFR by real time-PCR and Western blot.ResultsCompared with normal control group, MDA concentrations and activities of ALT and AST increased significantly in ethanol group(P<0.01). Compared with normal control group, FASN, SREBP-1c and p-EGFR expression both in gene and protein levels showed no significant changes in Gefitinib group(P>0.05), but increased in ethanol group(P<0.05 orP<0.01). Compared with ethanol group, the expression of FASN and SREBP-1c was decreased both in gene and protein levels in Gefitinib plus ethanol group(P<0.01), p-EGFR protein expression was also significantly decreased(P<0.05),while p-EGFR mRNA expression was still in the high value, but there was no significant difference(P>0.05).ConclusionFASN slightly expresses in normal liver cells, but highly expresses in ethanol-induced liver injury, which may be regulated by EGFR.

epidermal growth factor receptor；ethanol-induced liver injury；fatty acid synthase；tyrosine kinase inhibitor

陕西省自然科学基金资助项目(2012JQ4030)；西安交通大学第二附属医院人才培养专项科研基金资助项目(RC(BL)201301)

赵刚，男，1979-09生，在读博士，主治医师

2016-03-16

R575

A

1007-6611(2016)08-0689-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.003