鸡传染性支气管炎分离毒株病理组织学试验

郭宗凯　（山东省潍坊市高密乳肉兼用牛良种繁育改良中心　261500）

鸡传染性支气管炎分离毒株病理组织学试验

郭宗凯（山东省潍坊市高密乳肉兼用牛良种繁育改良中心261500）

鸡传染性支气管炎（IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种急性、高度接触传染性、病毒性呼吸道疾病。该病的主要特征是：病鸡咳嗽、打喷嚏、气管啰音；肾脏肿大、苍白，输尿管扩张、有大量尿酸盐沉积，外观呈现典型的“花斑肾”。IBV自然感染通常在48h内出现症状；人工接种后24h到7d始终可从鸡气管、肾、法氏囊中分离出病毒，不同日龄、品种和性别的鸡均易感，雏鸡常由于呼吸道或肾脏感染而引起死亡；幼鸡流鼻涕；蛋鸡产蛋数量和蛋的品质下降，给世界养鸡业带来了巨大的经济损失［1］。本试验是通过对实验室攻毒鸡各器官的病理切片进行观察，提供其动态病理学变化，为本病发病机制的研究提供初步的依据。

1　材料与方法

1.1病料来源病料来源：经培养增殖后获得的6株毒株感染鸡，取相应病变严重组织病料，进行福尔马林溶液固定。

1.2试验仪器生物病理切片机QPJ-1B，高级切片石蜡（熔点为54～60）℃，电热恒温水浴槽，六联电子调温万用电炉，电热恒温箱，光学显微镜OLYMPUS CH-2，载玻片。

1.3固定液配制及HE染液配制（1）10%福尔马林固定液：甲醛（40%）10ml、蒸馏水90ml配制而成。（2）10%中性福尔马林固定液：甲醛100ml、称量Na2HPO4·12H2O 39.5g、NaH2PO4·2H2O 10.95g，加蒸馏水至1000ml。（3）2.5%戊二醛：0.2M磷酸缓冲液50ml，25%戊二醛水溶液10ml，双蒸水加至100ml。（4）苏木素染液：苏木素0.9g、无水乙醇10ml、明矾15g、黄色氧化汞0.5g、蒸馏水。（5）伊红染液：伊红2g、蒸馏水100g。（6）l%盐酸酒精：75%酒精99ml、37%浓盐酸1ml。（7）苏木素染液配制：将苏木素0.9g溶于装有无水乙醇10ml的1000ml烧杯中，将明矾15g溶于200ml蒸馏水中，然后将二者混合，放在电炉上加热，至沸腾，关掉电源，加入0.5g黄色氧化汞后，转入冷水中迅速冷却，取出静止过夜，过滤。

2　试验方法

2.1取材分别采取攻毒后4d、7d、15d病死鸡的肾脏、肺脏、腺胃，选好切面，将其用手术刀进一步修成便于包埋的小块。以纵切为主，切面要修平整 。用生理盐水洗掉组织上的血块、污物、粘液等杂质。

2.2水洗将固定好的组织块由广口瓶中取出，用一层纱布包好，将每一组做好标记，放于大烧杯中，放在自来水水流下缓慢冲洗1d，以除去组织中的固定液。

2.3脱水将组织块放入50%乙醇中浸泡1.5h，再放入70%乙醇进行过夜，之后放入80%乙醇中浸泡1.5h，依次类推放入90%、95%、100%乙醇分别浸泡1.5h，最后进行透明处理。

2.4透明与浸蜡将脱水后的组织块依次浸入二甲苯中进行透明。透明时间不宜太长，20min为宜，然后将透明好的组织块，分好组放于58℃的电热恒温箱中依次浸入石蜡（如附表）。

附表　透明时间、浸蜡时间

2.5包埋浸蜡完成后，即做成包有组织的蜡块。将熔化的石蜡III倒入折好的纸盒内，再用热的镊子将组织块转入纸盒中。待石蜡结壳，将纸盒轻轻平稳拿起，放在阴凉处过夜。

2.6修蜡块将凝固好的蜡块进行修正。将包埋时蜡块的底面修成长方形或正方形。将有组织的一面按组织块所在的位置，保留组织周围大约5mm的边缘。修好的蜡块做好标记，并粘在小木块上。

2.7切片、展片与烘片将粘好木块的蜡块放在切片机上，调整好蜡块的位置，匀速转动切片机，当切出完整而连续的切片时，用干燥的毛笔将切片从切片刀上取下，光亮面向下平铺于42℃的恒温水浴箱中，等待蜡带上的细小皱折通过酒精的张力伸开、展平，然后用载玻片捞取完整的无皱褶的切片，置于载玻片中间偏左的位置。将水分稍晾干后，即刻放入60℃的烘烤箱中烘烤30min，使切片粘到载玻片上。

2.8HE染色（1）二甲苯去蜡（经2次）5～10min。（2）无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各1～2min，然后蒸馏水洗3min（换数次）。（3）苏木紫液染色约3～5min（视染液种类和着色情况增减）。（4）水洗；1%酸性乙醇或1%盐酸分化，显微镜下控制。（5）流水浸洗至少15min，至细胞核呈蓝色。也可短时水洗后，浸于40℃温水使核变蓝。（6）伊红液染0.5～1min后，95%乙醇2次，无水乙醇2次，约1～2min/次。（7）苯酚二甲苯（1∶3）5min。（8）二甲苯2次，3～5min/次。（9）用中性树胶或DPX以盖片封片，贴标签。

2.9封固观察将染好色的切片由染色缸中取出后，在组织上滴少许的树胶，然后用盖玻片从一侧开始盖片，树胶凝固后即可进行观察。

3　结果与分析

通过观察，分离自山东的6株鸡传染性支气管炎病毒，可引起鸡发病。引起的鸡传染性支气管炎，主要病理变化发生在气管、肺脏、肾脏、腺胃，肝脏也有部分病变。肺脏主要表现为出血、淤血、水肿和炎性细胞浸润；肾脏主要表现为肾小管上皮细胞肿胀、炎性细胞局灶性增生、核碎裂、核溶解；腺胃平滑肌间隙变宽、有淋巴样细胞浸润和大量上皮细胞坏死、腺体上皮细胞增生，管中有脱落的上皮细胞，腺体下平滑肌层被水肿液分隔，固有层水肿、有多量炎性细胞浸润。毛细血管充血、腺体上皮细胞大量空泡化，部分心肌细胞空泡化，腺腔中有黏液、脱落的腺细胞及单核细胞，并有大量的腺细胞坏死、脱落、崩解。在病变严重的病例，病变可以深入到平滑肌层，出现实质性变性蜡样坏死。肝脏主要表现为淤血，肝索紊乱，肝小叶界限不清。

4　结论

由于IBV的血清型很多，又具有高度传染性，鸡群同时感染不同毒株和使用弱毒疫苗发生基因重组而不断变异，使IBV侵害鸡体的靶器官也发生了变换。目前对IBV的研究很多，而关于腺胃变型IBV毒株的致病力和引起各器官的动态病理学变化，仅在山东地区有少许报道。一般认为肾型IBV主要靶器官为肾脏，主要靶细胞为肾小管上皮细胞，引起间质性肾炎的变化，至于其他组织器官中病毒的定位和分布则不太清楚。同时试验中组织学观察表明，用6株IBV分离株对鸡攻毒后，首先出现呼吸道症状，腺胃症状出现在肺脏、肾脏之后，其他一些器官也出现不同程度的临床症状。 病毒侵害呼吸器官后，引起气管水肿，炎性细胞浸润；肺脏出血，水肿，炎性细胞浸润，肺泡壁增厚；然后引起肾的损伤，肾小管上皮细胞肿胀，炎性细胞灶状增生，核溶解，核碎裂等，证实IBV首先会引起呼吸道的症状，之后会引起肾脏的病变。

S858.31文献标识码：B

1007-1733（2016）08-0033-02

2016-04-25）