水貂抗犬瘟热病毒中和抗体滴度的测定

刁非非　赵永峰　姜常青　韩铠怿　谢之景*　（①山东农业大学动物科技学院　山东 泰安　271018　①山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室　山东 泰安）

水貂抗犬瘟热病毒中和抗体滴度的测定

刁非非①①赵永峰①①姜常青①①韩铠怿①①谢之景①①*（①山东农业大学动物科技学院山东 泰安271018①山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室山东 泰安）

为了解当前犬瘟热疫苗及免疫程序的在水貂的免疫效果，该研究在6个水貂养殖场，随机对CD疫苗免疫接种后55～60d的水貂进行心脏采血，共采集、制备84份血清。采用血清微量中和试验，测定84份水貂血清中抗CDV的中和抗体滴度。结果表明，只有1份水貂血清中抗CDV的中和抗体滴度为94，占1.2%，其余83份血清样品中的抗CDV中和抗体滴度小于10，达98.8%。

水貂犬瘟热病毒中和抗体

当前水貂CD疫苗免疫程序的免疫效果很差，这是造成在水貂养殖过程中CD流行的重要因素，因此研究制定科学水貂CD疫苗免疫接种程序成为当务之急。犬瘟热（Canine Distemper，CD）是由犬瘟热病毒（Canine Distemper virus，CDV）引起犬科、鼬科、和浣熊科等动物的一种急性、高度接触性传染性疾病［1］。CDV是副粘病毒科麻疹病毒属的成员，病毒粒子呈多形性，多数呈球形，直径大多数在150～300nm之间，为负链单股不分节的RNA病毒，只有一个血清型。目前CDV自然感染的动物范围在不断扩大，除犬科外，人们又发现了许多CDV的新宿主，例如鼬科的雪貂、水貂，浣熊科的小熊猫、浣熊，猫科的猫、狮、孟加拉虎、豹，大熊猫科的大熊猫，偶蹄目猪科的猪，日本猕猴和人等。

CD在世界各地均有分布，所有养犬和经济动物的国家均有CD的发生。CD疫苗的应用在一定程度上控制了CDV的流行［2，3］，但是在实际生产过程中仍有许多疑似CDV感染的病例。CD在我国广泛存在，我国部分省市的皮毛动物特别是水貂饲养场不断有CD病例的出现，给养殖户造成很大的经济损失。造成免疫失败的原因较多，但其确切原因尚不清楚，其中疫苗免疫效果不好是造成免疫失败的一个重要原因。目前，有关CD疫苗免疫接种的效果尚不清楚，为此该研究对水貂血清中抗CDV中和抗体滴度进行了测定，为进一步研究科学的水貂CD疫苗接种程序提供了实验数据。本研究具有重要的生产实践意义。

1　材料和方法

1.1毒株与细胞CDV-M1本实验室分离鉴定保存，MDCK细胞由辽宁出入境检验检疫局胡传伟研究员惠赠。

1.2血清样品在诸城、东平、文登三地6个水貂养殖场，这6个水貂养殖场均对水貂进行了1次CD疫苗免疫接种，随机对CD疫苗免疫接种后55～60d的水貂进行心脏采血，制备血清，共84份，置-20℃冻存，待检。

1.3中和抗体效价的测定采用血清微量中和试验测定水貂血清抗CDV中和抗体效价。采用固定病毒—稀释血清法［4］，在96孔微量细胞培养板上进行。首先将血清样品置56℃水浴30min，灭活血清中非特异性病毒抑制成分，随后将血清样品中加入终浓度为0.025%恩诺沙星，10000r/min离心10min，去除可能的细菌污染物。先将血清稀释成1∶10，再作2倍连续稀释（共8个稀释度）。随后分别加入等量含100TCID50的病毒悬液。经25℃、2h感作后，分别加入96孔板，每个稀释度加4孔，每孔加100ul。然后将分散并稀释成2.5～3.0×106个/ml的MDCK细胞悬液加入96孔板，每孔加50ul，置5%CO2培养箱内（37℃，60%～80%湿度）培养。同时设血清毒性对照，阴阳性血清对照，病毒对照及正常细胞对照。4d判定结果，以每孔完全不出现蜘蛛样的融合性细胞病变作为中和阳性标准，以出现中和阳性的血清最高稀释滴度为中和终点，按Reed-Muench法计算血清的中和抗体效价，以其倒数作为水貂血清中抗CDV中和抗体滴度。

2　结果

在84份水貂血清中，只有1份水貂血清中抗CDV的中和抗体滴度为94，占1.2%，其余83份血清样品中的抗CDV中和抗体滴度小于10，达98.8%，见表1。抗CDV中和抗体滴度大于50，则动物对CDV具有很好的免疫抵抗力，在所检测的水貂血清样品中，疫苗免疫合格率仅为1.2%。这表明水貂血清中抗CDV的中和抗体滴度很低，水貂养殖企业所采用的CD免疫程序不合理，不能够诱导动物机体产生很好的抗体水平。

表1　水貂抗CDV中和抗体滴度

3　讨论

（1）山东省是水貂养殖大省，尽管CD疫苗的应用在一定程度上控制了CDV在水貂的流行，但是近年来，在实际生产过程中CDV的发病率越来越高，有时呈地方流行，给我省水貂养殖业造成了很大的经济损失。造成免疫失败的原因较多，但其确切原因尚不清楚。但是疫苗免疫效果不确实是造成免疫失败的一个重要原因。（2）中和抗体是当病原微生物侵入机体时会产生相应的抗体，是B淋巴细胞产生的适应性免疫应答细胞分泌的一种可溶性蛋白。病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。中和抗体是在病毒进入细胞之前破坏病毒的，能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体，破坏病毒颗粒，防止侵入细胞。中和抗体是抗病毒免疫的主要因素，也是疫苗免疫效果的重要检测指标之一。抗CDV中和抗体对于水貂抵抗CDV的感染是十分重要的。为了了解水貂CD疫苗的免疫效果，该研究对水貂血清中的抗CDV中和抗体水平进行了检测。（3）抗CDV中和抗体滴度大于50，则动物对CDV具有很好的免疫抵抗力，但检测结果表明，水貂血清中抗CDV的中和抗体滴度很低，98.8%的水貂血清中抗CDV中和抗体滴度小于10，只有仅为1.2%的水貂血清中抗CDV中和抗体滴度大于50。这表明水貂养殖企业所采用的CD免疫程序不合理，不能够诱导动物机体产生很好的抗体水平，这是造成CDV流行的重要因素。为此，应加强水貂CD疫苗免疫程序的研究，减少因该病造成的经济损失。

［1］Gassen U， Collins FM， Duprex WP， et al. Establishment of a rescue system for canine distemper virus. J Virol 2000 Nov； 74（22）∶ 10737-44.

［2］Franke-V； Matern-B； Ackermann-O； et al.The prevention of distemper in zoo animals. Berl-Munch-Tierarztl-Wochenschr. 1989 Feb 1； 102（2）∶56-8.

［3］Tizard-I. Grease， anthraxgate， and kennel cough∶ a revisionist history of early veterinary vaccines. Adv-Vet-Med. 1999； 41∶ 7-24.

［4］杨笃宝， 雷留真， 谢之景等. 幼狐犬瘟热母源抗体消长规律的测定［J］. 山东畜牧兽医. 2009， 8∶ 9-10

S852.65+5

A

1007-1733（2016）08-0012-02

山东省现代农业产业技术体系特种经济动物产业创新团队项目（SDAIT-21-07）。

2016-05-11）