麦芽糖浆预处理对酶法生产海藻糖的影响研究

张晓元,郝荣华,刘　飞,侯重文,朱希强

(山东省药学科学院山东福瑞达医药集团公司 山东省生物药物重点实验室 山东省多糖类药物工程实验室多糖类药物发酵与精制国家地方联合工程实验室,山东济南 250101)



麦芽糖浆预处理对酶法生产海藻糖的影响研究

张晓元,郝荣华,刘飞,侯重文,朱希强*

(山东省药学科学院山东福瑞达医药集团公司 山东省生物药物重点实验室 山东省多糖类药物工程实验室多糖类药物发酵与精制国家地方联合工程实验室,山东济南 250101)

利用酵母发酵法预处理去除麦芽糖浆中葡萄糖,以消除底物抑制提高酶法生产海藻糖产率。实验以产朊假丝酵母为发酵微生物,以麦芽糖浆中的葡萄糖去除率为指标,采用单因素及正交实验方法探讨不同因素对葡萄糖去除率的影响,并确定最佳工艺参数。结果表明:麦芽糖浆体积分数40%,酵母菌液接种量4%,pH5.5,温度32 ℃条件下,发酵 6 h后葡萄糖的去除率可达99.4%。以此糖浆为酶反应底物生产海藻糖,海藻糖产率由初始29.8%提高至58.4%,涨幅达96.0%。研究结果对工业化利用麦芽糖浆酶法生产海藻糖提供有效数据及理论支持。

产朊假丝酵母,麦芽糖浆,预处理,海藻糖

海藻糖获誉“生命之糖”,在脱水、干旱、低温、高渗透等恶劣环境下可对生物膜、蛋白质和核酸等生物大分子进行有效保护,进而维持生物体的生命过程和生物特征[1-4]。而葡萄糖、蔗糖、乳糖等其它糖类均不具备这一功能。独特的功能特性,使得海藻糖除广泛用作酶类、疫苗和其他生物制品的活性保护剂外,更可作为甜味剂、稳定剂、保鲜剂等应用于食品加工和储存,以有效保持食品新鲜风味及避免食品品质劣化[5-9]。

目前,海藻糖生产大都采用一步酶转化法,由tres基因编码的海藻糖合酶通过分子转糖基作用、异构反应将麦芽糖转化为海藻糖[10-13]。工业化生产上多采用麦芽糖浆替代纯麦芽糖粉,以降低生产成本,提高产品收益。麦芽糖浆主要成分为麦芽糖及少量葡萄糖、麦芽三糖、麦芽四糖,其中葡萄糖含量约5%～10%(以干物质计)[14-15]。生产中发现麦芽糖浆中过多葡萄糖成分会严重抑制海藻糖产率[16],因此对麦芽糖浆进行合适预处理来降低葡萄糖含量至关重要。Kyu Beomk等报道用模拟移动床分离色谱技术连续处理分离葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖[17]。但作为工业化生产原料预处理上应用,相对成本较高。酵母发酵法去除葡萄糖在木糖母液、玉米皮水解液、大豆低聚糖等生产上都有所报道,该法安全性高,价格低廉而广受市场欢迎[18-20]。但在麦芽糖浆预处理应用上尚未见报道。本研究选用产朊假丝酵母发酵法去除麦芽糖浆中葡萄糖,优化预处理工艺条件,以提高酶法生产海藻糖产率,为工业化生产提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

产朊假丝酵母YKY-Z81(CandidautilisYKY-Z81)本实验室筛选保存的耐高糖酵母菌;麦芽糖浆(固形物(80%),麦芽糖(50%),葡萄糖(10%)保龄宝生物股份有限公司提供;海藻糖合酶(适用pH5.5～6.5 酶活单位100 U/mL)本实验室构建基因工程菌株发酵获得;其他生化试剂均分析纯购自山东博尚生物科技有限公司。

生物传感仪SBA-40C山东省科学院生物研究所;液相色谱仪1200型美国安捷伦公司;六联发酵罐Infors ht 1000 mL瑞士INFORS公司。

1.2实验方法

1.2.1产朊假丝酵母菌液制备将活化后产朊假丝酵母CandidautilisYKY-Z81按1%～2%的接种量无菌条件下接种到YPD液体培养基中,30 ℃,200 r/min恒温培养至OD600=4～5,5000 r/min离心5 min,去除上清液,得到酵母泥。用前加入1/5发酵体积无菌水悬浮得酵母菌液,显微镜下血球计数板计数酵母菌数量控制在1～1.2×109个/mL。

1.2.2葡萄糖含量测定方法生物传感仪SBA-40C测定葡萄糖含量。

1.2.3海藻糖、麦芽糖测定方法参照文献[21]HPLC法检测,具体参数色谱柱:XBridgeTMNH2(3.5 μm×4.6 μm×250 mm);柱温:35 ℃;流动相:V乙腈∶V水=4∶1,配好后加0.1%氨水;流速:1.0 mL/min;检测器温度:40 ℃。

1.2.4单因素实验方法利用Infors ht 1000 mL六联发酵罐模拟工业化生产,进行平行反应实验。重点考察酵母菌液接种量、发酵温度、发酵pH、麦芽糖浆体积分数这四个主要因素,确定各参数的较优条件。六联罐参数设计如下:统一最终装液量70%(700 mL)、转速200 r/min、进气压力0.05 MPa、通气量0.2 L/min、DO不控制。发酵时间16 h,每2 h测定一次葡萄糖含量。

1.2.4.1酵母菌液接种量对去除葡萄糖效果的影响选用体积分数为50%的麦芽糖浆液,酵母菌液分别以1%、2%、3%、4%和5%的接种量,发酵温度28 ℃,pH6.5,进行去除葡萄糖发酵并定时测定葡萄糖含量。

1.2.4.2发酵温度对去除葡萄糖效果的影响麦芽糖浆体积分数50%,酵母菌液接种量为3%,分别在26、28、30、32、34 ℃温度下,pH6.5,进行去除葡萄糖发酵并定时测定葡萄糖含量。

1.2.4.3麦芽糖浆的pH对去除葡萄糖效果的影响麦芽糖浆体积分数50%,酵母菌液接种量为3%,发酵温度28 ℃,分别调节其pH为4.5、5.5、6.5、7.5,进行去除葡萄糖发酵并定时测定葡萄糖含量。

1.2.4.4麦芽糖浆体积分数对去除葡萄糖效果的影响麦芽糖浆体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%,酵母菌液接种量为3%,发酵温度28 ℃,pH6.5,进行去除葡萄糖发酵并定时测定葡萄糖含量。

1.2.5正交实验设计在单因素实验基础上,采用正交表L9(34)做正交实验(见表1)优选实验结果。每个处理重复3次,每次做3个平行。

表1　正交实验因素与水平设计

1.2.6海藻糖酶法合成参照文献[22]方法,(预处理)麦芽糖浆用0.02 mol/L pH6.5磷酸缓冲液稀释成40%体积分数稀释液,取95 mL稀释麦芽糖浆底物加入5 mL海藻糖合酶酶液,24 ℃反应30 h后,沸水浴10 min终止酶反应,12000 r/min离心10 min,上清液适当稀释后用HPLC测定生成的海藻糖量。

计算海藻糖产率(%)=反应液海藻糖量/反应液总糖含量×100

1.3数据统计分析

GraphPad Prism 6统计分析所有数据并制图。应用正交设计助手II V3.1软件对正交实验数据进行极差分析。

2　结果与讨论

2.1酵母接种量对去除葡萄糖效果的影响

由图1可知,在麦芽糖浆浓度和葡萄糖浓度等初始条件相同的情况下,葡萄糖去除效果与接种量呈正相关,接种量增加,葡萄糖去除速度增加。1%酵母菌液接种量去除葡萄糖速度最慢,发酵16 h,麦芽糖浆中仍有质量分数约0.3%葡萄糖存在。3%～5%酵母菌液接种量去除葡萄糖效果相差不大,发酵10 h时,葡萄糖质量分数可降低至0.3%左右,此后下降变缓,直至葡萄糖质量分数趋于零。因此可以得出,麦芽糖浆体积分数为50%时,接种3%酵母菌液,发酵10 h即可有效去除葡萄糖。

图1　不同接种量下葡萄糖浓度随时间的变化Fig.1　Effect of the addition of yeast on the result of removing glucose

2.2发酵温度对去除葡萄糖效果的影响

由图2可知,在26～32 ℃范围内,随着温度升高,葡萄糖去除效果越明显。主要原因在于,在一定温度范围内,随温度升高,酵母细胞内酶活性升高,生长繁殖加快,葡萄糖利用效率提高[23]。当温度提高至34 ℃时,过高温度影响菌体生长及菌体参与葡萄糖代谢相关酶活性[24]。因此选择32 ℃下进行葡萄糖去除较为恰当。

图2　不同温度下葡萄糖浓度变化Fig.2　Effect of the temperature on the result of removing glucose

2.3麦芽糖浆的pH对去除葡萄糖效果的影响

由图3可知,pH为7.5时,去除葡萄糖效果最差。pH为5.5和6.5时效果差别不大,去除葡萄糖效果较好。故麦芽糖浆的pH选为5.5～6.5。

图3　pH对葡萄糖去除效果的影响Fig.3　Effect of the pH on the result of removing glucose

2.4麦芽糖浆体积分数对去除葡萄糖效果的影响

由图4可知,麦芽糖浆体积分数越大,葡萄糖去除越慢。分析原因,麦芽糖浆浓度的增加对应葡萄糖浓度也增加,去除葡萄糖所需的时间也增长。另外,糖浓度的增加,酵母细胞周围的渗透压升高,影响酵母细胞生长及胞内营养物质的运输。当麦芽糖浆体积分数增加至60%以上时,葡萄糖去除速度明显变慢。麦芽糖浆体积分数30%、40%,葡萄糖浓度8 h内降至0.2%以下;麦芽糖浆体积分数50%时,葡萄糖浓度8 h内可降至0.7%以下。综合考虑后续海藻糖工业化生产时麦芽糖底物浓度要求30%～40%,预处理后麦芽糖浆还需进行pH调节及添加酶液,麦芽糖浓度会进一步稀释降低,故选择40%～50%体积分数麦芽糖浆较为合适。

图4　麦芽糖浆体积分数对葡萄糖去除效果的影响Fig.4　Effect of the concentration of malt syrup on the result of removing glucose

2.5正交实验设计

在单因素实验数据基础上,结合海藻糖工业生产上下游工艺及节能降耗、简化工艺目标,优化设计水平参数见表1,其中麦芽糖浆pH对下游海藻糖合酶稳定性影响较大,根据酶适用pH5.5～6.5范围,选取5.5、6.0、6.5三水平。控制预处理时间6 h,以葡萄糖残留浓度为指标,进行四因素三水平的正交实验确定最佳葡萄糖去除条件。

表2　L9(34)正交实验结果与分析

按表2进行正交实验,正交实验的结果进行极差分析,得到各因素对实验的影响的主要顺序是D>A>B>C,A2B2C1D1为较优方案,即酵母菌液接种量4%,发酵温度32 ℃,pH5.5,麦芽糖浆添加比例40%。根据正交实验结果做最佳因素的验证实验,麦芽糖浆预处理前后主要成分浓度变化见图5,可见麦芽糖浆中葡萄糖浓度由初始2.47%降低0.053%以下,接近于零;麦芽糖及糖浆中麦芽三糖、麦芽四糖等其他杂糖成分基本没有影响。

图5　麦芽糖浆预处理前后主要成分浓度变化及对海藻糖合成影响Fig.5　Concentration changes of main componentsand effects on the yield of trehalose beforeand after malt syrup pretreatment注：显著性差异p值p<0.05(*)；p<0.01(**)；p<0.001(***)。

2.6预处理麦芽糖浆对海藻糖酶法合成影响

分别以预处理前麦芽糖浆和预处理后麦芽糖浆为底物,利用海藻糖合酶进行麦芽糖转化生产海藻糖。HPLC法检测海藻糖产量,计算可知海藻糖生成率由初始29.8%提高至58.4%,涨幅达96.0%(图5)。

3　结论

通过实验,得出麦芽糖浆预处理较佳条件为:麦芽糖浆体积分数40%,产朊假丝酵母菌液接种量4%,pH为5.5,温度32 ℃条件下,经6 h发酵预处理,糖浆中葡萄糖浓度可降低至0.06%以下。有效降低了葡萄糖作为麦芽糖异构生产海藻糖反应副产物的反馈抑制作用,海藻糖产率也由初始29.8%提高至58.4%,涨幅达96.0%。该研究为工业化以麦芽糖浆为底物生产海藻糖提供了理论及数据支持。

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Effect of malt syrup pretreatments on the trehalose production by enzymatic method

ZHANG Xiao-yuan,HAO Rong-hua,LIU Fei,HOU Zhong-wen,ZHU Xi-qiang*

(Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences,Shandong Freda Pharmaceutical Group Company,Key Laboratory of Biopharmaceuticals,Engineering Laboratory of Polysaccharide drugs,National-Local Joint Engineering Laboratory of Polysaccharide drugs,Jinan 250101,China)

Removing the glucose from malt syrup could disarm the substrate inhibition and improve the trehalose production by enzymatic method. In this study,the removing efficiency of glucose from malt syrup was improved by yeast fermentation,and the fermentation parameters was optimized by mono-factor analysis and orthogonal test. Results showed that at the presence of 40% malt syrup,4% yeast,99.4% glucose could be removed from malt syrup after incubation for 6 hour at 32 ℃ pH5.5. As a consequence,the trehalose yield increased from 29.8% to 58.4% which was a 96.0% increase compared with that obtained before. Our results provide a promising strategy for industrial production of trehalose using malt syrup as substrate.

Candidautilis;malt syrup;pretreatment;trehalose

2015-11-19

张晓元(1979-)，男，硕士，高级工程师，研究方向：微生物技术，E-mail：gnice@163.com。

朱希强(1967-)，男，博士，研究员，研究方向：生物技术药物，E-mail：xistrong@sina.com。

山东省自主创新成果转化专项(2014GGZH1306)；济南市重大专项(201403009)。

TS202.1

A

1002-0306(2016)11-0161-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.025