太和香椿水提物对秀丽隐杆线虫生物学特征的影响及清除自由基作用的研究

杨京霞,李　静,吴　婷,张自备,石亚男,黄银生

(1.阜阳师范学院生物与食品工程学院,安徽阜阳 236037;2.抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心，安徽阜阳 236037;3.阜阳师范学院物理与电子工程学院，安徽阜阳 236037)



太和香椿水提物对秀丽隐杆线虫生物学特征的影响及清除自由基作用的研究

杨京霞1,2,李静1,吴婷1,张自备1,石亚男1,黄银生3,*

(1.阜阳师范学院生物与食品工程学院,安徽阜阳 236037;2.抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心，安徽阜阳 236037;3.阜阳师范学院物理与电子工程学院，安徽阜阳 236037)

目的:探讨太和香椿水提物对秀丽隐杆线虫生物学特征的影响,并研究水提物清除线虫体内自由基的作用。方法:用太和香椿水提物配制三种不同浓度的NGM培养基,检测每组线虫体长,寿命,体内氧自由基含量以及一分钟活动次数,分析太和香椿水提物对线虫生物学特征及抗氧化作用的影响。结果:浓度为0.5 mg/mL香椿水提物的实验组中线虫的平均体长、寿命、一分钟活动次数和体内氧自由基的含量与空白对照组相比,差异均极显著(p<0.01);表明该浓度下太和香椿水提物能够促进线虫的生长,并具有明显的清除自由基作用。

秀丽隐杆线虫,太和香椿水提物,延缓衰老

香椿是一种古老的菜用树种,除了可食用外,它还具有清热解毒、健胃理气、润肤明目等功效[1-2]。近代中医多以树皮、根皮入药,具有驱风祛湿、收敛止血、抗菌止痛等功效[3],多用于治疗肺咳、便血、菌痢、肠炎、崩漏等症。近年来人们对香椿药学实验的研究,使得香椿的药用及保健价值越来越被人们所认识,促进了香椿资源的更深层次的开发。安徽省太和县栽种香椿的历史悠久,且品质较高,唐代时曾用此物作为贡品,清朝时被御封为“贡椿”[4]。秀丽隐杆线虫生命周期较短为2～3周,是国际上研究衰老相关实验的典型模式生物[5-6]。目前文献报道的对太和香椿药用价值的研究较少,而关于香椿药用活性成分的研究主要集中在香椿总黄酮物质、酚类物质和挥发性物质上,对香椿水提物中的具体成分目前并未有研究。本实验以太和香椿为材料,研究其水提物对秀丽隐杆线虫体长、一分钟活动次数、体内氧自由基含量和寿命等指标,考察太和香椿在延缓衰老方面的作用。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

N2野生型秀丽隐杆线虫及大肠杆菌OP50中科院等离子体物理研究所吴李君研究员惠赠;太和香椿安徽省太和县;5-Fu尿嘧啶，DCFH-DA(2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐)美国Sigma公司;M9缓冲液(1 L水中加入3 g KH2PO4,6 g Na2HPO4,5 g NaCl和1 mL 1 mol/L的MgSO4);PBS缓冲液ThermoFisher公司;NaN3上海诚禀生物科技有限公司。

DM1000倒置荧光显微镜德国徕卡;RE-6000A旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;SW-CJ-1F超净工作台苏州净化设备有限公司;HVE-50高压灭菌锅日本Hirayama公司;ZSD-A1270生化培养箱上海智诚分析仪器制造有限公司。

1.2实验方法

1.2.1太和香椿水提物的制备将购买的太和香椿晒干后粉碎,准确称取干燥至恒重的粉末5.0000 g,加去离子水400 mL,60 ℃水浴加热1 h,取滤液。滤渣加水后再提取一次,合并滤液,用旋转蒸发仪浓缩,最后定容至50 mL,得0.1 g/mL的香椿水提物,4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2NGM(Nematode Growth Medium,线虫生长培养基)培养基的配制线虫的培养使用标准的NGM培养基,具体的配制方法参照文献[7],三个实验组分别用移液枪加入0.1、1、10 mL上述香椿水提物,121 ℃灭菌30 min,得到分别含有0.05、0.5、5 mg/mL不同浓度香椿水提物的实验组NGM培养基200 mL。

1.2.3线虫同步化用200 μL的M9缓冲液冲洗线虫,3000 r/min,离心1 min,去上清,然后加入裂解液1 mL于EP管中,静置10 min后,5000 r/min,离心1 min,最后用M9缓冲液冲洗3次,3000 r/min,离心1 min后,取下层,置于25 ℃下孵化12 h得L1幼虫,将L1幼虫转移到已培养好OP50的实验组和空白对照组的NGM培养基中;25 ℃培养30 h,得L4期成虫[8]。

1.2.4线虫寿命的测定挑选L4期的线虫15只[9],转移到实验组NGM培养基中,各培养基中均加入12.5 mg/L 5-Fu尿嘧啶以抑制子代线虫孵育[10]。每天记录线虫生存状况和存活个数,转移当天记为寿命实验第0 d,全部线虫死亡则实验结束。

1.2.5线虫体长的测定在线虫长到L4期后的第2 d,从每组中随机挑取5只线虫,经NaN3麻醉后放在显微镜下拍照,对其长度进行测量。

1.2.6线虫体内氧自由基含量的测定在线虫长到L4期后的第2 d,每组挑取5只线虫用荧光试剂盒染色[11-13](DCFH-DA),在倒置荧光显微镜下拍照,并用ipp图像分析软件分析照片中线虫荧光光密度,荧光光密度越强说明其体内氧自由基含量越多。

1.2.7线虫一分钟活动次数的测定每组分别随机挑取15只线虫置于含过量M9的培养皿中,在显微镜下观察并记录其每分钟活动次数。

1.2.8数据处理分析将不同浓度条件下得到的各组数据即线虫寿命、体长、线虫一分钟活动次数和线虫体内荧光光密度等数据进行X检验,计算结果由p值来表示显著性差异,如果p值小于0.05表示差异显著,p值小于0.01表示差异极显著。

2　结果与分析

2.1不同浓度太和香椿水提物对线虫寿命的影响

从表1中可以看出,香椿水提物可以延长线虫的寿命,但并不与浓度呈正相关,当浓度为0.5 mg/mL时,与其他三组差异极显著p<0.001,线虫平均寿命最长为(8.06±1.01)d,平均寿命指每组中各线虫实际寿命的平均值[14],说明该浓度的太和香椿水提物可以显著的延长线虫寿命,对于研究衰老具有积极意义。

表1　不同浓度香椿水提液对线虫寿命的影响

表2　不同浓度香椿水提物对线虫体长(μm)的影响

2.2不同浓度太和香椿水提物对线虫体长的影响结果

从图1、表2中可以看出,0.05 mg/mL组和5 mg/mL组对线虫体长的增长效果并不明显,而0.5 mg/mL组效果极显著(p<0.01)。由实验结果可以得出,浓度过低或者过高对线虫的生长促进作用并不明显,原因可能是浓度低时不能有效的促进线虫的生长,浓度高时可能抑制了线虫的生长,只有浓度适中时才能显著促进线虫的生长,使线虫体长明显增加。

图1　不同浓度香椿水提物对线虫体长的影响Fig.1　Effect of different concentrations of Cedar aqueous extract on the body length of nematodes

2.3不同浓度太和香椿水提物对线虫体内氧自由基的影响

氧自由基具有强氧化性,可损害机体的组织和细胞,进而引起慢性疾病及衰老效应。DCFH-DA(2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐)是非标记性的氧化敏感的荧光探针[15-16],DCFH-DA本身没有荧光,可以自由穿过细胞膜,进入细胞后,可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH可以迅速被自由基氧化成为具高荧光的物质—DCF。其氧化过程生成的DCF量与自由基的含量成正比,通过图像分析软件可以分析出检测DCF的荧光光密度以判定细胞内氧自由基的水平。图2为线虫光密度的荧光染色照片。

对四组线虫平均荧光光密度进行分析显示,0.5 mg/mL组与其他三组差异极显著(p<0.01),0.05 mg/mL组与0.5 mg/mL组差异显著(p<0.05)。通过对秀丽隐杆线虫体内荧光光密度的分析,荧光光密度越低,氧自由基含量越低,可见太和香椿水提物可以清除线虫体内氧自由基的含量。关于衰老的自由基学说早已被广大研究学者接受和认同,实验结果表明0.5 mg/mL香椿水提物的荧光光密度与空白组相比具有显著的清除自由基的功能,而早在1955年,Dr. Harman发表的 “衰老的自由基理论”就提出,体内产生过多自由基是引起衰老的重要因素[17],这一理论也得到科研工作者的广泛认同。本实验中香椿水提物能够有效的清除线虫体内的氧自由基,因此香椿水提物是一种很好的抗氧化剂,在延缓衰老方面有着积极的作用。

表3　不同浓度香椿水提物对线虫荧光光密度的影响

图2　不同浓度香椿水提物对线虫荧光光密度的影响Fig.2　Effect of different concentrations of Cedar aqueous extract on the fluorescence optical density of nematodes

2.4不同浓度太和香椿水提物对线虫一分钟活动次数的影响

对四组线虫每分钟平均活动次数进行分析得到0.5 mg/mL组与其他三组差异极显著(p<0.01)。说明0.5 mg/mL的太和香椿水提物可以增强线虫的活动能力,明显促进线虫的每分钟活动次数,对线虫的生长有积极作用。

表4　不同浓度香椿水提物对线虫活动次数(次/min)的影响

3　结论与讨论

本文中关于香椿水提物的浓度参考查阅了相关文献,文献对于香椿提取物的研究浓度多集中在0.01～10 mg/mL的范围内。台湾学者对香椿萃取物进行研究,体外实验显示,香椿叶、树皮和根皮的萃取物在浓度为0.625 mg/mL时香椿清除DPPH自由基能力达80%[18]。故本实验研究的低中高三个浓度定为0.05、0.5和5 mg/mL,通过一系列实验研究表明,浓度过低或者过高都不适于线虫的生长,当浓度为0.5 mg/mL时各个生物学特征的指标最好。实验结果显示太和香椿水提物可以促进线虫的生长,在抗氧化和延缓衰老方面有着积极作用。但对于水提物的具体成分还有待于进一步分析研究。

[1]刘忠良.香椿的研究概况[J].基层中药杂志,2001,16(4):57-58.

[2]郝继伟.浅谈香椿的资源价值与利用[J].江苏农业科学,2003(5):102-103.

[3]陈铁山,罗忠萍,崔宏安,等.香椿化学成分的初步研究[J].陕西林业科学,2000,(2):1-2,22.

[5]蔡外娇,张新民,黄建华,等.淫羊藿总黄酮延缓秀丽隐杆线虫衰老的实验研究[J].中国中西医结合杂志,2008,28,(6):522-523.

[6]秦峰松,杨崇林.小线虫,大发现:Caenorhabditis elegans在生命科学研究中的重要贡献[J].生命科学,2006;18(5):419-424.

[4]杨京霞,杨阳,李文雍,等.高效液相色谱法测定太和香椿中槲皮素的含量,药物生物技术,2010,17(6):513-515.

[7]Stiernagle T.Maintenance of C.elegans[M].Oxford University Press,2006:1-11.

[8]Wen SH,Zhang T,Tan T W.Utilization of am ino acids to enhance glutathione production in Saccharom yces cerevisiae[J].Enzyme MicroTech,2004,31(1):122-126.

[9]陈咏竹.孙启玲.γ-多聚谷氨酸的性质发酵生产及应用[J].微生物学报,2004,31(1):122-126.

[10]王香婷,朱晓红,魏民,等.补气活血方药对衰老性急性肺损伤大鼠SOD及MDA的影响[J].中国中医基础医学杂志,2009(06):434-436.

[11]于文涛,张一昕,吴中秋,等.补肾活血方对血管性痴呆小鼠行为学及脑海马自由基代谢的影响[J].中国老年学杂志,2009(12):1478-1479.

[12]杨静,雷燕,崔巍,等.人参三七川芎提取物延缓内皮细胞复制性衰老的机制研究[J].中国中药杂志,2009(12):1545-1547.

[13]Harman D. Aging:a theory based on free radical and radical and radiation chemistry[J].J Gerontol,1956,11:298-300.

[14]许湘,许巧,郭岚,等.六味地黄丸对秀丽隐杆线虫寿命及daf-2mRNA、daf-16mRNA表达的影响[J].世界科学技术-中医药现代化,2015,17(1):73-75.

[15]M. Kobayashi.Invivoantioxidant role of astaxanthin underoxidative stress in the green alga Haematococcus pluvialis.Appl[J]. Microbiol Biotechnol,2000,54:550-555.

[16]Smith J A,W eidemann M J. Further characterization oftheneutroph il oxidative burst by flow cytometry[J].Immunol Methods,1993,162:261-268.

[17]赵保路.自由基、营养、天然抗氧化剂与衰老[J].生物物理学报,2010,26(1):26-36.

[18]台湾香椿研究团队,台湾香椿同好.继往开来-台湾之椿[M].香椿乡村研发俱乐部,2014,139-144.

Effects of Taihe Cedar aqueous extract onC.Elegansbigoloical characteristics and scavenging free radicals

YANG Jing-xia1,2,LI Jing1,WU Ting1,ZHANG Zi-bei1,SHI Ya-nan1,HUANG Yin-sheng3,*

(1.College of biological and food engineering,Fuyang normal college，Fuyang 236037,China;2.Anti-aging Chinese herbal medicine in anhui province engineering technology research center，Fuyang 236037,China;3.College of physics and electronic engineering,Fuyang Normal College，Fuyang 236037,China)

Objective:To study the influence of Taihe Cedar aqueous extract on Caenorhabditis elegans(C.Elegans)biological characteristics and the scavenging free radicals ability in the body of the water extract clear nematodes. Methods:The length,life span,activity and content of oxygen free radicals of nematodes which cutlured by NGM culture medium with three different concentration of the Taihe cedar aqueous extract were measured to investigated the effect of Taihe Cedar aqueous extract on the biological characteristics and the antioxidant ability of nematodes.Results:Compared with control,significant differences were observed on the average length,longevity,activity times per minute and the content of oxygen free radicals of nematodes cultured with concentration of 0.5 mg/mL cedar aqueous extract(p<0.01).The experimental results showed that the concentration of Taihe Cedar water extract could promote the growth ofC.Elegans,and possess obvious effect of scavenging free radicals.

C.Elegans;Cedar aqueous extract;anti-aging

2015-07-13

杨京霞(1982-),女,硕士,讲师,主要从事中草药成分及活性研究,E-mai:yangjingxia1228@126.com。

黄银生(1978-),男,硕士,讲师,主要从事计算物理和生物物理学,E-mai:81313140@qq.com。

安徽省教育厅自然科学研究重点项目(KJ2016A872);安徽省教育厅自然科学一般项目(2014KJ009);安徽高校科研平台创新团队建设项目;安徽省大学生创新创业训练项目(AH201310371051,201510371059,20151062,20151068);阜阳师范学院校级自然科学研究项目(2013FSKJ17)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)11-0328-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.059