低温储存期间原料乳微生物预测模型建立

张宏伟,郑冬梅,*,孔保华,肖洪亮,韩光毅

(1.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030;2.黑龙江省完达山乳业股份有限公司,黑龙江哈尔滨 150036)



低温储存期间原料乳微生物预测模型建立

张宏伟1,郑冬梅1,*,孔保华1,肖洪亮2,韩光毅2

(1.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030;2.黑龙江省完达山乳业股份有限公司,黑龙江哈尔滨 150036)

本研究对秋季低温储存原料乳进行预测微生物学研究。使用Gompertz模型建立4～14 ℃储存的秋季原料乳中总菌落和嗜冷菌的生长动力模型。模型可以有效的模拟秋季原料乳中微生物的生长情况,模型的相关系数均大于0.972,可以用来预测微生物生长情况和达到控制下限的时间。研究表明嗜冷菌是低温储存的原料乳中优势微生物,在4～8 ℃储存温度下总菌落数与嗜冷菌的数量呈很好的相关性(R2=0.931),可以通过总菌数推算出嗜冷菌的数量,保证乳制品的品质。

原料乳,低温储存,预测微生物

乳及乳制品是易腐的食品,如果储存不当就会引起腐败菌和致病菌的迅速生长,随着冷藏设备的广泛应用,嗜冷菌逐渐成为影响乳制品保质期的主要因素。Ingram将耐冷菌定义为能在≤5 ℃的条件下生长的微生物[1]。Morita定义嗜冷菌(Psychrophiles)就是指那些最适生长温度等于或低于15 ℃,上限温度等于或低于20 ℃的微生物的总称[2]。嗜冷菌种类繁多,嗜冷菌中细菌就有30多个属,常见如假单胞菌属、产碱杆菌属、无色杆菌属、黄杆菌属、克雷伯氏菌属[3]。检测原料乳中嗜冷菌数量的方法有多种,常见的方法是在6.5 ℃培养10 d后计数[4],或将样品21 ℃增菌培养后,采用选择性培养基在21 ℃培养25 h后,将样品中革兰氏阴性(G-)杆菌作为嗜冷菌污染的指标[5],经典的微生物培养方法在时间及针对性上都存在严重的缺陷。PCR和流式细胞技术由于比较高昂的仪器购置费用、需要专业的操作人员以及乳品中微生物群系的复杂性,限制了这些技术在生产实践中的应用。

预测微生物学是运用微生物学和统计学进行数学建模,利用所建模型预测和描述处在特定食品环境下微生物的生长和死亡,评估食品的安全性[6-10]。建立预测模型的目的是预测在一定的条件下食品中微生物的数量何时达到威胁人类健康的水平或者影响微生物灭活的程度,预测微生物学的关键在于使用从实际食品中获得的数据建立完整的数据库,利用这个数据库建立含有多种影响因子的预测数学模型[11-12],预测在外界环境因素和食品中微生物共同作用下的食品中微生物数量何时达到威胁人类健康的水平[7]。

低温储存已经逐渐成为原料乳储存的常用方法,随着存储方式的改变,原料乳中优势微生物也发生变化,国内对标准化牧场产原料乳在低温储存过程中的微生物变化系统研究较少,为填补这一研究空缺,本研究通过对不同低温储存温度和储存时间的原料乳进行总菌落数和嗜冷菌数测定和模型建立,并对模型进行分析,探讨总菌落数和嗜冷菌数的关系,以期达到快速估算原料乳中微生物数量的目的。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

原料乳采自标准化奶牛集中饲养小区;营养琼脂、营养肉汤北京奥博星生物技术有限责任公司;脱脂奶粉(蛋白质含量32.2%,脂肪含量2.0%,水分含量3.6%)黑龙江省完达山乳业股份有限公司。

JD500-2电子天平沈阳龙腾电子称量仪器有限公司;ZDX-30KBS自动灭菌锅上海申安医疗器械厂;DL-CJ-1N医用超净工作台、HZQ-F160全温震荡培养箱哈尔滨东联公司;LRH-250生化培养箱上海一恒科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1原料乳的采集与处理新鲜机械榨取的牛乳,在5 t乳罐中搅拌并快速冷却至4 ℃,从乳罐中取乳样30 kg,使用碎冰屑保持低温,样品在30 min内送到实验室。将原料乳样品摇匀后进行无菌分装,放入指定保藏温度的全温培养箱,以80 r/min震荡培养。

1.2.2菌落总数的测定采用GB/T4789.2-2010方法检测菌落总数,对不同储存温度和储存时间的原料乳中菌落总数进行测定[15]。

1.2.3嗜冷菌的测定采用BS ISO 17410-2001方法检验嗜冷菌数,对不同储存温度和储存时间的原料乳中嗜冷菌菌数进行测定[16]。

1.2.4原料乳中微生物生长曲线的测定每隔一定的时间取出试样,用0.85%生理盐水对试样牛乳进行适当稀释,使菌浓度控制在103～104CFU/mL,用平板计数法测定菌落数。

1.2.5预测微生物模型建立采用Gibson等人引入的非线性模型-Gompeertz函数对微生物生长曲线进行描述,这个函数的基础是微生物的比生长速率随着营养水平和产生的有毒代谢产物变化。可以假设不同的N0有不同的迟滞期。典型的比生长速率增长到最大后就会下降[17]。Gompertz函数的形式如下:

LogN=a+cexp{-exp[-b(t-m)]}

N-CFU/mL,在某个时间的菌数;a-细菌的对数期的无限短时间内的渐近线;c-对数生长期任意一时间的菌数的渐近线;m-h-绝对生长速率最大的时间;b-绝对生长速率最大时的相对生长速率。

使用这四个参数可以通过logN和相对应的时间进行非线性回归得出[17-18],制作出模型后,可以通过模型推断出在某个时间时菌数是多少或者达到某个菌数的时间,这对食品的储存具有一定的指导意义。

1.3数据分析

实验取3个平行实验的数据分析进行平均值和误差项,采用Sigmaplot 10.0绘图。初级模型的制作使用SAS软件的牛顿迭代程序对微生物生长数据进行处理,使用Gompertz模型建立初级生长预测模型。

2　结果与分析

图1　秋季原料乳在不同储存温度条件下总菌落生长模型Fig.1　The growth model of total colony in the raw milk of autumn at different storage temperature conditions

2.1低温储存原料乳中微生物生长模型建立

由图1～图3和表1相应的生长动力模型可以得出,随着储存温度的升高,总菌数达到最大生长速率的时间逐渐减少,从4 ℃储存的24.4 h降低到14 ℃储存的15 h,达到稳定期的微生物增长量也随着储存温度的升高而增加,从4 ℃储存的0.41 log10CFU/mL增加到14 ℃储存的1.96 log10CFU/mL。嗜冷菌菌数达到最大生长速率的时间从4 ℃储存的31.53 h降到14 ℃储存的24 h,达到稳定期的微生物增长量也随着储存温度的升高而增加,从4 ℃储存的0.49 log10CFU/mL增加到12 ℃储存的1.39 log10CFU/mL,在14 ℃储存时的嗜冷菌的增长量下降。在低温条件下,嗜冷菌增长量占总菌落增长量的绝大部分,甚至超过总菌落的增长量(4、6、10 ℃),可知在低温储存的原料乳中嗜冷菌是生长繁殖的优势菌,嗜冷菌数量和总菌落数量有一定比例关系。

使用Gompertz模型建立的原料乳中总菌生长动力模型的R2>0.974,嗜冷菌生长动力模型的R2>0.972,表明使用Gompertz模型建立的4～14 ℃储存秋季原料乳中总菌和嗜冷菌的生长动力模型是适合的,该模型可以有效的模拟秋季原料乳中微生物的生长情况。

表1　秋季原料乳中微生物预测模型

图2　秋季原料乳在不同储存温度条件下嗜冷菌生长模型Fig.2　The growth model of psychrophile in the raw milk of autumn at different storage temperature conditions

图3　储存温度对Gompertz模型参数的影响Fig.3　Storage temperature on the parameters of the Gompertz model

2.2不同储存温度的原料乳中总菌落数与嗜冷菌数量的关系

由图4和表2可以得出,总菌落数随着嗜冷菌的数量增长而增加,呈正相关,在4～8 ℃储存温度下相关系数较高,为0.931,但是10～14 ℃储存温度下相关系数较低,为0.623%。原料乳多在10 ℃以下条件下储存,因此可以利用嗜冷菌数量与总菌落数量呈正相关的趋势来快速推断原料乳中嗜冷菌的数量。

图4　原料乳中总菌落数与嗜冷菌数量的关系Fig.4　The relationship between total colonyand psychrophilic in raw milk

3　讨论

本研究使用SAS软件的牛顿迭代程序对原料乳中微生物生长数据进行处理,使用Gompertz模型建立初级生长预测模型,实验使用Gompertz模型建立的原料乳中总菌生长动力模型的R2≥0.974,嗜冷菌生长动力模型的R2≥0.972,表明使用Gompertz模型建立的4～14 ℃储存不同季节原料乳中总菌和嗜冷菌的生长动力模型是适合的。牛顿迭代成功建立模型的关键在于对预测模型参数进行预估,尤其是起始菌数和最大生长量的预估对模型的建立起到关键的作用。起始菌数通常可以通过生长曲线的迟滞期来进行估计,最大生长量可以通过稳定期和迟滞期的菌数差来估计。

表2　总菌落数(x)与嗜冷菌数量(Y)的关系

在较低的储存温度条件下原料乳中嗜冷菌是主要增长的微生物[19]。实验表明在4～14 ℃储存条件下的嗜冷菌增长的数目占总菌增长数目的大部分,这与储存条件和嗜冷菌自身的性质有关,在较低的储存温度条件下,嗜温微生物生长缓慢,但是嗜冷菌仍然以相对较快地生长[20]。

Cempírková在1999至2000年的研究表明,原料乳嗜冷菌与菌落总数有相关性,相关性达到0.920[21],本研究结果与Cempírková的研究结果相似。可以利用原料乳嗜冷菌与菌落总数有相关性这种关系,根据菌落总数快速推断出嗜冷菌的数量。

4　结论

本研究建立4～14 ℃储存的秋季原料乳中总菌落和嗜冷菌的生长动力模型,模型可以有效的模拟秋季原料乳中微生物的生长情况,模型的相关系数均大于0.972,可以用来预测微生物生长情况。原料乳在低温条件下储存可以抑制原料乳中微生物的生长,随着储存温度的降低,微生物生长速率逐步减缓。嗜冷菌是低温储存的原料乳中优势微生物,低温储存的原料乳中总菌数与嗜冷菌有一定的相关性,在4～8 ℃储存温度下总菌落数与嗜冷菌的数量呈很好的相关性,相关系数为0.931,可以通过总菌数快速推算出嗜冷菌的数量。

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Establishment of predicting model for raw milk at low temperature storage

ZHANG Hong-wei1,ZHENG Dong-mei1,*,KONG Bao-hua1,XIAO Hong-liang2,HAN Guang-yi2

(1.Food school of Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Heilongjiang Wondersun Dairy Limited Company,Harbin 150036,China)

To predict the microbiological analysis of raw milk stored at low temperature in autumn. The Gompertz model was used to establish the growth kinetic model of total colony and psychrophilic in raw milk in the autumn raw milk stored in 4～14 ℃.The model could effectively simulate the growth of microorganisms in raw milk in autumn,and the correlation coefficient of the model was higher than 0.972,which could be used to predict the growth of microorganisms and the time to reach the control limit. The study showed that psychrophile was the main microorganism among raw milk stored at low temperature. It was good while the store temperature was between 4～8 ℃(R2=0.931). The number of the bacteria could be calculated by the total number of bacteria,which could ensure the quality of dairy products.

raw milk;low temperature storage;prediction microbiology

2015-12-02

张宏伟(1982-)，男，硕士，实验师，研究方向：畜产品加工，E-mail:120680287@qq.com。

郑冬梅(1963-)，女，硕士，教授，研究方向：食品安全，E-mail:zdm1234@126.com。

国家支撑计划课题(2012BAD12B05)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)11-0122-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.017