蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液中甲醛生成相关自由基的影响

李颖畅,朱学文,白　杨,信维平,杨　玉,张　笑,励建荣

(渤海大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121013;辽宁省食品安全重点实验室,辽宁锦州 121013;生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013)



蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液中甲醛生成相关自由基的影响

李颖畅,朱学文,白杨,信维平,杨玉,张笑,励建荣*

(渤海大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121013;辽宁省食品安全重点实验室,辽宁锦州 121013;生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013)

本文通过电子自旋共振(ESR)技术测定了鱿鱼上清液中与甲醛生成相关的自由基,同时研究了蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液高温甲醛产生相关的自由基影响。结果表明:Fe2+促进鱿鱼上清液(CH3)3N·的产生;不同浓度的蓝莓叶多酚使鱿鱼上清液中(CH3)3N·强度降低,浓度越高降低越显著;随加热时间的延长,(CH3)3N·强度增加,加热时间超过75 min后,蓝莓叶多酚对(CH3)3N清除能力下降;随温度的升高,(CH3)3N·信号增强,高温加热15 min,对蓝莓叶多酚清除(CH3)3N·能力无影响;pH6.0的反应体系产生的(CH3)3N·比pH7.0反应体系产生的自由基信号强,蓝莓叶多酚在pH6.0的反应体系清除(CH3)3N·清除能力较强。初步证明鱿鱼上清液中甲醛产生的非酶途径中存在自由基反应,蓝莓叶多酚通过与自由基反应抑制甲醛的形成。

蓝莓叶多酚,鱿鱼上清液,甲醛,(CH3)3N·

甲醛是一种毒性很强的物质,少剂量的甲醛能引起人疼痛、呕吐、昏睡,大剂量的甲醛能引起死亡。甲醛可直接作用于蛋白质的氨基、巯基、羟基和羧基,破坏蛋白质和酶[1]。同时使组织细胞产生不可逆的凝固、坏死,从而对人的神经系统、肺、肝脏产生损伤,造成免疫功能的异常[2]。甲醛容易与细胞亲核物质发生化学反应,导致DNA损伤[3]。水产品在加工与贮藏过程中会产生大量内源性甲醛。为了有效控制水产品中甲醛含量,对甲醛形成的机理研究非常必要。鱿鱼等水产品内源性甲醛产生主要有生物途径和非酶途径:生物途径是指鱿鱼等水产品在酶特别是氧化三甲胺去甲基酶和微生物的作用下自行产生甲醛。非酶途径主要是高温过程中氧化三甲胺的热分解产生的甲醛[4]。Hattori Lin[5]等人发现鱿鱼在加热过程中会产生甲醛、二甲胺和三甲胺,并认为该反应是鱿鱼体内氧化三甲胺热分解引起的。

为了有效降低水产品中甲醛含量,对水产品内源性甲醛的控制和机理研究十分必要。有研究发现干香菇在蒸煮过程中产生的甲醛和半胱氨酸结合形成四氢噻唑-4-羧酸,这不仅减少了甲醛,且此物质能够与人体内的亚硝酸盐结合,预防和控制癌症的产生[6-7]。励建荣等[8]研究也表明茶多酚对甲醛的捕获效果显著。朱军莉等[9]研究发现柠檬酸、柠檬酸钠、氯化钙、茶多酚和白藜芦醇对鱿鱼提取物中氧化三甲胺分解有抑制作用。李颖畅等[10]研究发现蓝莓叶多酚具有抑制鱿鱼丝加工过程氧化三甲胺分解,降低鱿鱼丝中甲醛作用。Lin[11]等人还发现Fe(II)对氧化三甲胺热分解的促进作用与Fenton反应十分相似,并推测鱼体内氧化三甲胺的非酶分解途径可能是通过自由基来实现的。Ferris[12]等人证实TMAO在Fe(II)催化下通过(CH3)3N自由基反应生成甲醛、二甲胺和三甲胺。Zhu等[13]和励建荣等[14]研究表明秘鲁鱿鱼加热过程中伴随甲醛的生成,产生了自由基,证明秘鲁鱿鱼中甲醛产生的非酶途径中存在自由基反应,内源性甲醛的产生与自由基的形成有关。蓝莓叶多酚对鱿鱼制品内源性甲醛的抑制作用是否与自由基有关,关于蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液中甲醛生成相关自由基的影响还为见报道。电子自旋共振(ESR)能监测自由基中的单电子自旋翻转所产生的共振现象,成为直接检测自由基的唯一可靠的方法。由于自由基极不稳定,因此可利用自旋捕集剂与自由基反应生成相对稳定的加合物,通过测定该加合物来表征原有自由基,自旋捕集技术使ESR用途更为广泛。本文采用电子自旋共振(ESR)技术研究了蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液中甲醛生成相关自由基的作用。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

蓝莓叶沈阳农业科学发展研究院提供;秘鲁鱿鱼购于锦州市林西路水产市场。

无水乙醇、氢氧化钠、盐酸天津市致远化学试剂有限公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris)北京Solarbio科技有限公司;乙酸天津市大茂化学试剂厂;2-苯叔丁基硝酮(PBN)北京百灵威生物科技有限公司。以上试剂无特殊说明均为分析纯。

RRH-100型万能高速粉碎机欧凯莱芙(香港)实业公司;MS105DU电子分析天平METTLER TOLEDO公司;DHG-9123A 电热鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司;SORVALL Stratos冷冻高速离心机美国Thermo公司;HH-6型数显恒温水浴锅国华电器有限公司;RE-52AA旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;SHB-III循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司;FE20型pH计,METTLER TOLEDO公司;Milli-Q超纯水系统美国Millipore公司;FreeZone台式冻干机美国Labconco公司;HE-2S恒流泵上海青浦沪西仪器厂;MJ-25BM05A 绞肉机广东美的精品电器制造有限公司;DRX-400电子自旋共振仪德国BRUKER公司。

1.2实验方法

1.2.1蓝莓叶多酚样品的制备参照李颖畅等[15]的方法,稍作修改,将蓝莓叶45 ℃烘干,用粉碎机粉碎。取20 g蓝莓叶粉末按1∶20(g/mL)(m/v)的料液比溶于70%乙醇(v/v),60 ℃恒温水浴锅水浴2 h。取上清液进行抽滤,滤液用旋转蒸发仪在50 ℃下进行浓缩,得到蓝莓叶多酚浓缩液。用AB-8型大孔树脂对粗提液进行纯化,减压浓缩,将浓缩液真空冷冻得到蓝莓叶多酚粉末。将其储藏于密封袋中,4 ℃保存备用,Folin-Ciocalteu法测定多酚含量[16]。

1.2.2鱿鱼上清液的制备10 g样品经过去皮,去骨,去内脏后,绞碎,取碎鱿鱼肉,按1∶2(g/mL)(m/v)与20 mmol/L Tris-乙酸缓冲液(pH7.0)混合,匀浆,冰浴超声30 min,12000 r/min离心15 min,取上清液,4 ℃冷藏备用。

1.2.3自由基的检测方法将0.5 mL样品(0.25 mL鱿鱼上清液+0.25 mL蓝莓叶多酚溶液)装入离心管中,加入15 mg PBN使其终浓度达到0.37 mol/L,混匀,在一定温度下水浴加热一定时间,促使自由基产生。以蒸馏水代替蓝莓叶多酚作为对照,检测自由基的变化。ESR测定条件:中心磁场3510.00 G,微波功率32.28 mW,调制频率100 kHz,调制幅度10.00 G,室温,扫描时间40.96 s。

1.2.3.1Fe2+对鱿鱼上清液产生自由基的影响 鱿鱼上清液+0.2 mmol/L Fe2+,0.05 g/L蓝莓叶多酚+鱿鱼上清液+0.2 mmol/L Fe2+,分别在100 ℃水浴锅中处理15 min,以PBN为自旋捕捉剂,检测自由基的变化。

1.2.3.2不同浓度的蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液产生自由基的影响在0.25 mL鱿鱼上清液中分别添加浓度为0、0.005、0.05、0.1 g/L蓝莓叶多酚溶液0.25 mL,添加PBN后在100 ℃加热15 min,检测自由基的变化。

1.2.3.3蓝莓叶多酚对不同加热时间下的鱿鱼上清液产生自由基的影响在0.25 mL鱿鱼上清中添加浓度为0.05 g/L蓝莓叶多酚溶液0.25 mL,加PBN后并在100 ℃分别加热15、30、75、90 min,检测自由基的变化。

1.2.3.4蓝莓叶多酚对不同温度下的鱿鱼上清液产生自由基的影响0.25 mL鱿鱼上清中添加浓度为0.05 g/L蓝莓叶多酚溶液0.25 mL,添加PBN后,分别在80、90、100 ℃加热15 min,检测自由基的变化。

1.2.3.5蓝莓叶多酚对不同pH下的鱿鱼上清液产生自由基的影响在0.25 mL鱿鱼上清中添加浓度为0.05 g/L蓝莓叶多酚溶液0.25 mL,分别调pH为6.0,7.0,添加PBN后,在100 ℃加热15 min,检测自由基的变化。

图1　Fe2+对鱿鱼上清液产生(CH3)3N·的影响Fig.1　Effects of Fe2+on the generationof (CH3)3N· in squid supernatant注:(a)鱿鱼上清液,(b)鱿鱼上清液+Fe2+,(c)鱿鱼上清液+Fe2++0.05 g/L蓝莓叶多酚。

2　结果与分析

2.1Fe2+对鱿鱼上清液自由基产生的影响

如图1a,图1b所示,加热处理后,在3460～3560 G的磁场下产生明显的六重峰自由基信号,且添加Fe2+的鱿鱼上清液中自由基信号显著增强,Zhu等[13]对秘鲁鱿鱼内源性甲醛进行研究认为Fe2+是促进鱿鱼中甲醛生成的主要影响因子,本文与Zhu等研究一致,Fe2+促进鱿鱼上清液中自由基的产生。图1c为在鱿鱼上清液+Fe2+体系中添加蓝莓叶多酚产生的自由基信号,从图1c中可以看出,蓝莓叶多酚使自由基信号减弱,蓝莓叶多酚减弱自由基信号可能与多酚螯合金属离子有关。同时,蓝莓叶多酚为多羟基化合物,可以与(CH3)3N·发生反应,从而抑制鱿鱼上清液中氧化三甲胺(TMAO)热分解生成甲醛。

2.2不同浓度的蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液产生自由基的影响

图2　不同浓度的蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液产生(CH3)3N·的影响Fig.2　Effects of different concentration blueberryleaf polyphenols on the generation of (CH3)3N· in squid supernatant

对不同浓度蓝莓叶多酚与鱿鱼上清液反应样品中的自由基进行检测,结果如图2所示,不添加蓝莓叶多酚的鱿鱼上清液经过高温处理后产生了明显的六重峰自由基信号。随着蓝莓叶多酚浓度的增加,处理后的鱿鱼上清液中自由基信号逐渐减弱,当浓度达到0.1 g/L时自由基信号基本为基线峰。由此可知,蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液氧化三甲胺(TMAO)高温热分解的抑制可能通过其对自由基的清除途径来实现。Ferris等[12]证实TMAO在Fe(II)催化下通过(CH3)3N自由基反应生成甲醛、二甲胺和三甲胺。王尧耕[17]发现鱿鱼中铁含量在21.33～36.30 μg/g之间,Fe2+促进自由基产生。鱿鱼上清液中有一定量的Fe2+,促进(CH3)3N·信号的产生。励建荣等[14]在鱿鱼上清液中捕捉到相同的自由基信号并验证了鱿鱼中甲醛的产生与自由基存在密切的关系,本文与此研究是一致的。内源甲醛的产生与高温加工产生的自由基有关,蓝莓叶多酚清除鱿鱼上清液中产生自由基,这与蓝莓叶多酚抑制鱿鱼丝加工过程氧化三甲胺热分解[10],降低鱿鱼丝中甲醛作用是一致的。

图3　不同处理时间下蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液产生(CH3)3N·的影响Fig.3　Effects of blueberry leaf polyphenols on the generation of(CH3)3N· in squid supernatant in different time

图4　不同处理温度下蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液产生(CH3)3N·的影响Fig.4　Effects of blueberry leaf polyphenols on the generation of (CH3)3N· in squid supernatant in different temperature

2.3蓝莓叶多酚对不同时间下的鱿鱼上清液产生自由基的影响

图3表明蓝莓叶多酚在不同加热时间下对鱿鱼上清液中(CH3)3N·的影响。随着加热时间的增加,(CH3)3N·的信号逐渐增强,蓝莓叶多酚使自由基信号减弱,这与鱿鱼上清液反应中TMAO含量随着加热时间的增加而降低以及添加蓝莓叶多酚后鱿鱼上清液中TMAO含量升高的现象一致,进一步说明(CH3)3N·的生成与加热时间有关,蓝莓叶多酚可通过与鱿鱼体内的(CH3)3N·反应而阻止甲醛的生成;加热时间超过75 min后,蓝莓叶多酚稳定性降低,清除(CH3)3N·能力降低。蓝莓叶多酚的稳定性与蓝莓叶多酚组成以及多酚化合物的结构是有关的。

2.4蓝莓叶多酚对不同温度下的鱿鱼上清液产生自由基的影响

图4显示了蓝莓叶多酚在不同处理温度下对鱿鱼上清液中(CH3)3N·的影响,随着处理温度的升高,产生的(CH3)3N·增多,自由基的信号逐渐增强,添加蓝莓叶多酚的鱿鱼上清液中自由基信号强度受到抑制。上清液自由基的变化与鱿鱼上清液反应中TMAO含量随着温度的升高而降低的结果相一致,而添加蓝莓叶多酚后鱿鱼上清液中自由基的变化与TMAO含量升高的结果一致。Lin和Hurng[11]对干鱿鱼进行加热发现温度越高氧化三甲胺分解成三甲胺、二甲胺和甲醛比例越高;温度超过200 ℃,大约90%的氧化三甲胺都进行了热分解。说明氧化三甲胺分解产生甲醛和(CH3)3N·自由基的产生与温度有关,且蓝莓叶多酚对鱿鱼内源性甲醛的抑制作用与自由基变化有关。

2.5蓝莓叶多酚对不同pH下的鱿鱼上清液产生自由基的影响

图5表明蓝莓叶多酚对不同pH下的鱿鱼上清液产生自由基的影响。相对pH7.0的鱿鱼上清液,pH6.0的鱿鱼上清液中产生的自由基信号较强,蓝莓叶多酚在pH6.0的鱿鱼上清液中清除(CH3)3N·也较强,说明蓝莓叶多酚在pH6.0的鱿鱼上清液中比较稳定,清除自由基能力较强。Mizuguch等[18]研究表明pH影响冻藏鱼肉的氧化三甲胺分解和二甲胺形成。本文研究表明pH影响鱿鱼上清液自由基信号强度和蓝莓叶多酚对自由基的清除能力。可能原因是pH影响多酚的解离状态,进而影响其与自由基的结合能力。

3　结论

Fe2+对鱿鱼上清液(CH3)3N·的产生有促进作用;不同浓度的蓝莓叶多酚使鱿鱼上清液中(CH3)3N·信号强度降低,蓝莓叶多酚浓度越高,自由基信号降低越显著。鱿鱼上清液加热过程中产生了(CH3)3N·;随加热温度的升高和处理时间的延长,(CH3)3N·信号强度增加;鱿鱼上清液中加入蓝莓叶多酚后,(CH3)3N·信号减弱。pH6.0的反应体系产生的(CH3)3N·比pH7.0反应体系产生的自由基信号强,蓝莓叶多酚在pH6.0的反应体系清除(CH3)3N·能力较强。初步证明鱿鱼上清液中甲醛产生的非酶途径中存在自由基反应,蓝莓叶多酚通过与自由基反应抑制氧化三甲胺的分解和甲醛的生成。

图5　不同pH下蓝莓叶多酚对鱿鱼上清液产生(CH3)3N·的影响Fig.5　Effects of blueberry leaf polyphenols on the generation of (CH3)3N· in squid supernatant in different pH

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Effect of blueberry leaf polyphenols on free radicals in the formation of formaldehyde in squid supernatant

LI Ying-chang,ZHU Xue-wen,BAI Yang,XIN Wei-ping,YANG Yu,ZHANG Xiao,LI Jian-rong*

(College of Food Science and Technology,Bohai University,Jinzhou 121013,China;Food Safety Key Lab of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China;National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China)

The free radical which is related to formaldehyde in squid supernatant was determined by ESR. At the same time,the effect of blueberry leaf polyphenols on free radicals in squid supernatant was studied at high temperature. The results showed that Fe2+promoted(CH3)3N· in squid supernatant. Different concentrations of blueberry leaf polyphenols decreased(CH3)3N· in the squid supernatant,and the higher concentration decreased more significantly. The(CH3)3N· was increased with heating time prolonging. Scavenging capacity of blueberry leaf polyphenols was decreased when heating time was over 75 min. The(CH3)3N· were enhanced with the temperature increasing. There was no affect on blueberry leaf polyphenols scavenging (CH3)3N· at high temperature heating for 15 min. The(CH3)3N· in reaction system of pH6.0 was more than that in reaction system of pH7.0. The scavenging ability in pH6.0 was stronger than in pH7.0. This work indicated that radical reaction existed in non-enzymic formation mechanism of formaldehyde in squid supernatant. The formation of formaldehyde was controlled through the reaction of blueberry leaf polyphenols with free radical.

blueberry leaf polyphenols;squid supernatant;formaldehyde;(CH3)3N·

2015-11-19

李颖畅(1973-)，女，博士，副教授，研究方向：水产品的加工与贮藏, E-mail:liyingchangsy@sina.com。

励建荣(1964-)，男，博士，教授，研究方向：水产品的加工与贮藏,E-mail:lijr6491@163.com。

国家自然基金(31201308)；“十二五”国家科技支撑计划(2012BAD29B06)。

TS254.4

A

1002-0306(2016)11-0103-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.013