辣木叶水溶性蛋白的超声微波萃取及其性质研究

吕晓亚,白新鹏,*,伍曾利,杨慧强,熊桂林

(1.海南大学食品学院,海南海口 570228;2.海南思坦德生物科技股份有限公司,海南海口 570000)



吕晓亚1,白新鹏1,*,伍曾利2,杨慧强1,熊桂林2

(1.海南大学食品学院,海南海口 570228;2.海南思坦德生物科技股份有限公司,海南海口 570000)

研究辣木叶中可溶性蛋白的提取工艺及其性质。采用超声-微波协同萃取方法提取辣木叶中可溶性蛋白,在单因素实验的基础上,通过Box-Behnken 中心组合实验确定最佳工艺参数,并对蛋白质氨基酸组成进行分析。实验结果表明:当料液比1∶160(g/mL),微波功率40 W,提取时间127 s,pH11,在此工艺条件下,辣木叶蛋白得率为40.11 mg/g。氨基酸分析表明,辣木叶可溶性蛋白中必需氨基酸含量为280.7 mg/g,含硫氨基酸含量较高,苏氨酸为第一限制性氨基酸。差示扫描量热仪(DSC)分析表明辣木叶可溶性蛋白的变性温度为113.7 ℃。

辣木叶,超声微波,蛋白质

辣木(Moringaoleifera),又名鼓槌树,为辣木科(Moringaceae)、辣木属(MoringaAdans)多年生木本植物,原产于热带、南亚热带的干旱或半干旱地区,在我国主要种植于台湾、广东、海南、云南等南方地区。辣木中含有十分丰富而全面的营养成分,具有降血糖、降血压、保护肝脏、保护心脏、抗菌消炎等作用[1],广泛应用于食品、药品和工业生产中。其中,辣木叶中含有丰富的纤维素、蛋白质、维生素以及微量元素[2]。研究表明[3],辣木叶蛋白质中含有19种氨基酸,其中含有8种人体生命活动所需的必需氨基酸,与花生、大豆、棉籽等其他植物性蛋白相比,辣木叶蛋白的生物效价和营养价值均较高,是一种极具开发潜力的优质植物性蛋白,2012年我国国家卫生和计划生育委员会将辣木叶批准为新资源食品。

近些年超声-微波协同萃取技术广泛应用于提取植物中的生物活性物质,利用超声振动的空化作用以及微波的高能作用[4]能有效缩短提取时间,加速植物中有效成分溶出,降低高温对热敏物质的影响,提高其提取效率与提取质量。辣木叶作为一种新资源食品,国内外研究较少,且主要集中于其抗菌和抗氧化以及动物饲养等方面,关于其蛋白质方面的研究较少。本实验以辣木叶为原料,采取超声-微波辅助碱法提取辣木叶水溶性蛋白,并采用响应面法对pH、微波功率、提取时间以及料液比四个因素,与其交互作用进行优化,研究超声-微波协同提取辣木叶可溶性蛋白的最佳工艺,并对提取出的蛋白质进行理化性质分析,为辣木叶蛋白的深入研究和工业化生产提供有效的参考依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

辣木叶采自海南大学种植园(粗蛋白含量为18.46%);牛血清白蛋白生化纯,国药集团化学试剂有限公司;其他试剂均为分析纯。

FW177型中草药粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司;SH220型石墨消解仪济南海能仪器有限公司;CW-2000型超声-微波协同萃取仪新拓微波溶样测试技术有限公司;101-1-BS型电热恒温鼓风干燥箱上海跃进医疗仪器厂;GL-20G-II型低温冷冻离心机上海安亭科学仪器厂;PHS-3D型pH计上海精科？;EL204型电子天平梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;923型可见光分光光度计上海奥普勒仪器有限公司;FDU-2100冷冻干燥机上海爱朗仪器有限公司;Q100差示扫描量热仪(DSC)美国TA仪器公司;2695型高效液相色谱waters公司(美国)。

1.2工艺流程

辣木叶→蒸馏水洗净→50 ℃干燥→粉碎→加浸提溶剂→超声微波协同萃取→离心5000 r/min,15 min→上清液→蛋白质含量测定→酸沉→离心8000 r/min,10 min→沉淀→冷冻干燥

1.3单因素实验

1.3.1溶剂pH对辣木叶可溶性蛋白得率的影响准确称取一定质量的辣木叶粉在料液比1∶80(g/mL),微波功率50 W,超声微波处理时间120 s的前提下,改变溶剂pH(8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5),对辣木叶可溶性蛋白进行提取,计算蛋白得率。

1.3.2料液比对辣木叶可溶性蛋白得率的影响准确称取一定质量的辣木叶粉在pH10.5,微波功率50 W,超声微波处理时间120 s的前提下,改变料液比(1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160、1∶180),对辣木叶可溶性蛋白进行提取,计算蛋白质得率。

1.3.3微波功率对辣木叶可溶性蛋白得率的影响准确称取一定质量的辣木叶粉在pH10.5,料液比1∶140 g/mL,超声微波处理时间120 s的前提下,改变微波功率(40、50、60、70、80 W),对辣木叶可溶性蛋白进行提取,计算蛋白质得率。

1.3.4超声微波处理时间对辣木叶可溶性蛋白得率的影响准确称取一定质量的辣木叶粉在pH10.5,料液比1∶140 g/mL,微波功率50 W的前提下,改变超声微波处理时间(60、120、180、240、300 s),对辣木叶可溶性蛋白进行提取,计算蛋白质提取率。

1.3.5不同pH对辣木叶可溶性蛋白酸沉的影响取蛋白质上清液30 mL,调节不同的pH(2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6),8000 r/min 10 min,测上清液中可溶性蛋白质的含量。

1.4Box-Behnken中心设计

在单因素提取实验基础上,采用Box-Behnken中心设计原理,对影响辣木叶蛋白得率的料液比、微波功率、超声微波处理时间、溶剂pH采用Design-Expert.8.05b分析软件设计了4因素3水平中心组合设计,实验因素水平设计见表1、实验方案与结果见表2。

表1　实验因素水平及编码表Table 1　Levels and factors of orthogonal design

1.5测定方法

1.5.1蛋白质测定方法考马斯亮蓝G-250法[5]

Y:蛋白质得率(mg/g)；m1:提取液中蛋白质量(mg)；m2:辣木叶样品质量(g)。

1.5.2氨基酸分析准确称取100mg的辣木蛋白冷冻干燥后样品,加6mol/LHCl,110 ℃水解22h,取1mL氨基酸水解液真空干燥,加入1mLpH2.2的盐酸溶解,过0.45μm滤膜,溶液转移到样品瓶中备用。采用AccQ·Tag氨基酸分析方法进行分析(参考Waters公司AccQ·Tag化学试剂包使用手册)。

1.5.3氨基酸评价采用WHO人体必需氨基酸模式,将辣木叶蛋白中必需氨基酸含量除以参考的蛋白质中必需氨基酸含量,比值最低者,为限制性氨基酸。由于限制性氨基酸的存在,使得食物中蛋白质的利用率降低,因而降低辣木叶蛋白的生物利用率。

蛋白质的氨基酸评分=每g待评蛋白质中某种必需氨基酸含量(mg)/每g标准蛋白中某必需氨基酸含量(mg)×100

1.5.4辣木叶可溶性蛋白热变性温度的测定参照文献[6-7]的方法,将上清液装入已处理好的透析袋中(截留分子量在14ku),4 ℃透析脱盐24h,真空干燥浓缩,取一定质量的浓缩液,放入特定的铝盒,以空白为对照,氮气为载气,扫描温度范围20～200 ℃,升温速率为10 ℃/min条件下进行DSC分析。

1.6数据处理方法

所有实验进行三次平行实验,数据采用Design-Expert8.0.5b软件统计学方法进行处理。

2　结果与分析

2.1辣木叶可溶性蛋白提取的单因素实验

2.1.1溶剂pH对辣木叶可溶性蛋白得率的影响由图1可知,在使用超声微波法提取蛋白中,蛋白质得率随着溶剂pH的升高呈先升高后降低的趋势,在8.5～10.5范围内,得率逐渐升高,在pH10.5时达到最高,为33.88mg/g,随后蛋白质得率开始缓慢下降。这是由于蛋白质在强碱环境中会发生极端变性,从提取液中沉淀出来,从而降低了提取液中可溶性蛋白的含量。此外,加入过多量的碱会引起蛋白质的脱氨、脱羧反应,对辣木叶蛋白的理化性质和营养价值造成不利影响,故pH选择10.5。

图1　pH对蛋白得率的影响Fig.1　Effect of pH on the yield of protein

2.1.2料液比对辣木叶可溶性蛋白得率的影响由图2可知,随着溶剂体积的不断增加,蛋白质得率呈逐渐增加的趋势,当料液比为1∶140 g/mL时,辣木叶蛋白质得率达到最高值40.00 mg/g。这是因为增加溶剂量,使得辣木叶粉与溶剂接触面的浓度差增加,提高了传质速率。液料比继续增加时,溶液的黏度增大,蛋白质溶出的阻力增大,导致蛋白质得率下降,因此确定料液比为1∶140 g/mL。

图2　料液比对蛋白得率的影响Fig.2　Effect of ratio of meal to solvent on the yield of protein

2.1.3微波功率对辣木叶可溶性蛋白得率的影响由图3可知,随着微波功率的增大,蛋白质得率出现先增大后减小的趋势,在微波功率为50 W时,蛋白质得率达到最大值40.02 mg/g。继续增加微波功率,蛋白质得率开始下降,这可能是由于微波功率过大易造成温度过高使蛋白质分解,导致蛋白质的得率降低。因此微波功率选用50 W。

图3　微波功率对蛋白得率的影响Fig.3　Effect of microwave power on the yield of protein

2.1.4超声微波处理时间对辣木叶可溶性蛋白得率的影响由图4可知,在处理时间为120 s时,上清液中蛋白质的含量最高为39.96 mg/g,随着时间的延长,蛋白质含量开始下降。这可能是由于超声微波辐射在较短时间内对辣木叶细胞膜的破碎作用明显,蛋白质溶出多,所以得率上升较快。但当蛋白质的溶解度接近饱和时,水溶性物质不再溶解,且随着时间的延长,超声微波过程中不断产热,使蛋白质发生变性,从而影响蛋白质的品质。

图4　处理时间对蛋白得率的影响Fig.4　Effect of extract time on the yield of protein

2.1.5不同pH对辣木叶可溶性蛋白酸沉的影响由图5可知,在酸沉pH为3.2时,上清液中残留的蛋白质含量最少,体系pH为蛋白质的等电点,此时,蛋白质正、负电荷数相同,蛋白质与蛋白质之间由于静电排斥作用降低而发生聚合沉淀。因此在pH为3.2的条件下,酸沉所得到的蛋白质最多,由此可知辣木叶蛋白的等电点在3.2附近。

图5　pH对蛋白质酸沉的影响Fig.5　Effect of pH on protein acid precipitation

2.2Box-Behnken 中心设计及其响应面法优化辣木叶可溶性蛋白的提取工艺

4因素3 水平中心组合设计实验因素水平及结果见表2。

由表2可知,辣木叶可溶性蛋白得率与料液比、微波功率、处理时间、溶液pH四因素的数学回归模型为:

Y=38.64+0.54A-0.49B+1.45C+2.61D+0.17AB+1.77AC-0.54AD+1.91BC-3.19BD-0.84CD-1.52A2-1.35B2-1.87C2-1.76D2

表2　实验设计及结果Table 2　Results of the orthogonal experiment

回归分析结果见表3。根据方差分析显著性检验结果可知:该模型回归显著,且方程决定系数(R2)为0.8690,该模型与实验拟合度较好,自变量与响应值影响显著,说明该回归方程适用于辣木叶可溶性蛋白提取的理论预测。其中C、D、BD、C2对辣木叶可溶性蛋白质得率的影响高度显著,AC、BC、A2、B2、D2对辣木叶可溶性蛋白提取的影响显著,A、B、AB、AD、CD对辣木叶可溶性蛋白提取的影响不显著。影响辣木叶可溶性蛋白提取的主次因素依次为D>C>A>B,即pH>提取时间>液料比>微波功率。在σ=0.05显著水平剔除不显著项,得出优化后的方程:

Y=38.64+1.45C+2.61D+1.77AC+1.91BC-3.19BD-1.52A2-1.35B2-1.87C2-1.76D2。

为进一步确定最佳点,利用Design-Expert.8.0.5.0软件对工艺条件进行优化,可得辣木叶蛋白提取的最佳条件为:料液比1∶160,微波功率40 W,提取时间127 s,pH11,在此工艺条件下,辣木叶蛋白得率的预测值为40.16 mg/g。为验证响应面分析方法的可靠性,采用上述最优条件进行蛋白的提取,并与表2中实验结果较好的1号及15号在相同的实验条件下作对比实验,并进行三次重复验证实验。在最优条件下测得辣木叶蛋白的得率为40.11 mg/g,1号工艺条件下平均得率为39.42 mg/g,15号工艺条件下的平均得率为39.86 mg/g。结果证明,在最佳工艺条件下,辣木叶蛋白的浸出量均超过前面任一条件下的,同时也证明了响应面分析方法的可靠性。因此采用响应面分析方法优化得到的辣木叶可溶性蛋白提取条件参数准确,具有一定实用价值。

表3　回归分析结果Table 3　Regression analysis of Box-Behnken design

注:*为0.05水平上显著,**为0.01水平上显著。

2.3辣木叶可溶性蛋白的氨基酸分析

对辣木叶可溶性蛋白氨基酸组成与含量进行了分析,并对几种必需氨基酸进行化学评分。辣木叶可溶性蛋白氨基酸组成与含量见表4。由于酸水解使色氨酸完全破坏,谷氨酰胺、天冬酰胺转变为谷氨酸和天冬氨酸,因此酸水解测定氨基酸中没有色氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的值。另外,丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸在酸水解处理过程中受到某种程度的破坏,所以他们的测定值比实际值要低。甘氨酸可能由于其含量较低而未能检出。

由表4可见,辣木叶可溶性蛋白中氨基酸组成比较丰富,含有16种氨基酸,总量为861.8 mg/g,其中包括7种必需氨基酸,总量为280.7 mg/g,非极性氨基酸占总氨基酸含量的30.28%,中性极性氨基酸占总量的27.22%,带正电荷氨基酸占总量的22.64%,带负电荷氨基酸含量占总量的19.86%,16种氨基酸中半胱氨酸和谷氨酸含量较高,分别占氨基酸总量的17.07%,12.79%。

表5　辣木叶可溶性蛋白的氨基酸评分Table 5　Amino acid score of Moringa leaf soluble protein

表4　辣木叶可溶性蛋白氨基酸组成与含量(mg/g)Table 4　The composition and content of amino acid in Moringa leaf soluble protein(mg/g)

注:“-”表示未检出。

由表5可知,在辣木叶可溶性蛋白氨基酸组成中,必需氨基酸含量丰富,与人体需求较为接近,其中含硫氨基酸含量较高,苏氨酸为第一限制性氨基酸,其氨基酸评分为83。与其他植物蛋白相比,辣木叶可溶性蛋白是一种优质的蛋白质资源。

2.4辣木叶可溶性蛋白的热变性温度

热变性温度是蛋白质加工的一个重要影响因素,温度升高使得蛋白质变性,蛋白质三、四级结构展开,导致产品的功能性质明显降低或丧失[9]。蛋白质的变性温度受水分含量影响变化很大,由于含水量低会使得蛋白质的聚集效应增加,峰形变宽,峰值温度升高,变性焓增加。蛋白质的变性温度体现在蛋白质稀溶液的变性温度,蛋白质只有溶解于水中,才能呈现出特定的三维立体结构来支撑蛋白质的各种功能性质[10],因此本实验对辣木叶可溶性蛋白稀溶液进行DSC扫描确定其变性温度。由图6可知,在100～120 ℃温度范围内出现一个吸热峰,峰值变性温度为113.7 ℃,高于麦胚球蛋白和大豆分离蛋白[11]。由于二硫键是蛋白质中唯一的共价交联键,二硫键含量越高,二硫键断开所需的能量就越大,蛋白质的变性温度就越高,由氨基酸分析结果可知,辣木叶可溶性蛋白中半胱氨酸含量较高,占氨基酸总量的17.07%,因此辣木叶可溶性蛋白具有较高的热变性温度。

图6　辣木叶可溶性蛋白稀溶液的DSC 扫描图Fig.6　DSC scan of Moringa leaf soluble protein in dilute solution

3　结论

以辣木叶干粉为原料,采用超声-微波协同萃取辣木叶可溶性蛋白,在单因素实验的基础上,通过Box-Behnken 中心组合实验确定最佳工艺参数:料液比1∶160(g/mL),微波功率40 W,提取时间127 s,pH11,在此工艺条件下,提取的辣木叶蛋白含量为40.11 mg/g,为辣木叶可溶性蛋白的大规模提取提供了一个有效的工艺参数。但超声-微波辅助提取的辣木叶可溶性蛋白与传统方法提取的辣木叶蛋白在结构和功能性质上的区别有待进一步的研究和探讨。

通过氨基酸分析可知,辣木叶可溶性蛋白氨基酸种类比较齐全,必需氨基酸含量为280.7 mg/g,各氨基酸含量与推荐标准接近,含硫氨基酸含量较高,苏氨酸为第一限制性氨基酸,与其他植物蛋白相比,辣木叶可溶性蛋白是一种优质的蛋白质资源。

由于辣木叶可溶性蛋白中半胱氨酸含量较高,二硫键含量高,使得其稀溶液的变性温度较高,为113.7 ℃,略高于其他植物蛋白。但稀溶液中水分含量对辣木叶可溶性蛋白质热稳定性的影响有待进一步深入研究。

[1]贺艳培,王倩,孔令钰.辣木的研究进展[J].天津科技,2013,2:87-90.

[2]Nouman Wasif，Siddiqui Muhammad，Basra Shahzad，et al. Biomass production and nutritional quality of Moringa oleifera as a field crop[J].Turkish Journal of Agriculture and Forestry,2013,37:410-419.

[3]Moyo Busani，Masika Patrick，Hugo Arnold，et al. Nutritional characterization of Moringa(Moringa oleifera Lam.)leaves[J]. African Journal of Biotechnology,2011,10(60):12925-12933.

[4]Kapper，Alexander. Microwaves in organic and medicinal chemistry[M]. Weinheim：Wiley-VCH,2005.

[5]王永华.食品分析(第二版)[M].北京:中国轻工业出版社,2011:128.

[6]黄友如,华欲飞,王晓虹.DSC在大豆蛋白功能性质研究中应用[J].粮食与油脂,2003,08:15-17.

[7]卢雁,李向荣.蛋白质变性机理与变性时的热力学参数研究进展[J].化学进展,2005,17(5):905-910.

[8]FAO/WHO. Energy and Protein requirement[R].RePort of joint FAO/WHO,Geneva:WHO,1973.63.

[9]Noisuwan Angkana，Bronlund John，Wilkinson Brian，et al. Effect of milk protein products on the rheological and thermal(DSC)properties of normal rice starch and waxy rice starch[J]. Food Hydrocolloids，2008,22(01):174-183.

[10]朱科学,周惠明.麦胚球蛋白的分离制备及理化性质研究[J].中国粮油学报,2005,20(6):15-18.

[11]于源,张敏,邵弘.差示扫描量热法在大豆蛋白产品品质检测中的应用[J].大豆通报,2008,1:26-28,36.

Extraction and physicochemical properties of soluble protein from Moringa leaves by ultrasonic and microwave

LV Xiao-ya1,BAI Xin-peng1*,WU Zeng-li2,YANG Hui-qiang1,XIONG Gui-lin2

(1.Food college,Hainan University,Haikou 570228,China;2.Hainan Standard Bio-Technique Corp.,Ltd,Haikou 570000,China)

To study the extraction and physicochemical properties of soluble protein from Moringa leaves. Application of ultrasonic and microwave assisted extraction of protein was studied using dry Moringa leaves as a raw material by single factor experiment. The best extraction conditions were determined by Box-Behnken center united experimental design as follows:the ratio for material and liquid was 1∶160(g/mL),microwave power of 40 W,extracting time of 127 seconds,pH value of 11,under which the yield of protein in the extracts reached 40.11 mg/g. Amino acid analysis showed that content of essential amino acids of Moringa leaf protein was 280.7 mg/g. The content of sulfur amino acid was high. The first limiting amino acid(LAA)was threonine. Differential scanning calorimetry(DSC)analysis showed that the soluble protein thermal denaturation temperature of Moringa leaf was 113.7 ℃.

Moringa leaves;ultrasonic and microwave;protein

2015-06-29

吕晓亚(1990-)，女，硕士研究生(在读)，研究方向：农产品贮藏及加工，E-mail:lxy5409@sina.com。

白新鹏(1963-)，男，博士，教授，研究方向：粮食、油脂和植物蛋白质工程，E-mail:xinpeng2001@126.com。

国家高技术研究发展计划(863计划)：蛋白质微生物发酵技术研究(2013AA10 2203-08)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)05-0212-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.033