大海马ACE抑制肽制备及其抗氧化能力的测定

顾　伟,徐永健

(宁波大学海洋学院/应用海洋生物技术重点教育部实验室,浙江宁波 315211)



大海马ACE抑制肽制备及其抗氧化能力的测定

顾伟,徐永健*

(宁波大学海洋学院/应用海洋生物技术重点教育部实验室,浙江宁波 315211)

为了从大海马蛋白中制备出ACE抑制肽及分析肽的抗氧化能力,本文通过比较小分子肽与ACE间的关系对蛋白酶进行了选择,筛选出木瓜蛋白酶作为海马蛋白的水解酶。然后,在单因素实验基础上采用响应面法对木瓜蛋白酶制备ACE抑制肽的关键参数进行了优化,结果为酶底比(E/S)为 5%、时间7.5 h、pH7.7、温度59 ℃,测得其水解度为20.41%±0.12%,ACEIPs的IC50值为1.897±0.072 mg/mL。经Sephadex G-15分离纯化后,得到五个组分,其中第三个组分(PH-I3)、第4个组分(PH-I4)和第5个组分(PH-I5)的活性最好,IC50分别为0.896、0.982、0.814 mg/mL;并对这五个组分进行了抗氧化实验,各组分均能显著的清除DPPH自由基、羟基自由基,具备与Fe2+的螯合能力。所以,由PH-I制备的ACE抑制肽同时具有降血压和抗氧化的功能,在功能性食品开发中具有重要的意义。

大海马高分子蛋白,ACE抑制肽,抗氧化能力,木瓜蛋白酶

治疗和预防高血压是当今研究的一个热门的课题[1]。在高血压的调节机制中,血管紧张素转化酶(ACE)对血压的调节起着重要的作用,所以通过抑制ACE的活性是治疗高血压的一种重要方法[2]。目前,化学合成的ACE抑制剂具有强效的同时也产生了许多副作用,因此寻找一种高效无副作用的ACE抑制剂具有重要的意义[2]。从蛋白质酶解产物中分离出的ACE抑制肽(ACEIPs)具有效果温和、专一、高效和无副作用等特点,体现出良好的开发价值,如从大豆蛋白[3]、白莲蛋白[4]、燕麦蛋白[5]等酶解液中分离出ACE抑制肽,并开发出多种相应的产品。

自由基与人体的许多疾病都密切相关,现在已经发现糖尿病、衰老和氧化应激损伤等疾病都与自由基的氧化反应有关。氧化应激能够使血管受到某种程度上的损伤,从而引起高血压等心血管疾病。正是由于自由基与许多疾病都密切相关,所以抗氧化药物越来越多在高血压等疾病上得到了应用。许多学者发现ACE抑制肽同时具有抗氧化的功能,如朱丽娟[6]发现玉米蛋白水解物具有抗氧化能力的同时还具有抑制ACE活性的能力;Miguel等[7]通过给自发性高血压大鼠饲喂高含量的抗氧化剂,发现能够有效的降低大鼠血压,这证实了自由基对大鼠的血管有一定的损伤,抗氧化剂能够降低血液中氧自由基的浓度,改善血管的结构和功能,从而起到降低大鼠血压的能力。

大海马含有较高的蛋白成分,自古为食药同源生物[8]。对大海马蛋白成分的分析与有效成分提取,将有效提高海马蛋白的利用价值。本研究重点对大海马蛋白进行酶解分析,并从酶解液中分离纯化与抗高血压有关的多肽类物质,并对其进行抗氧化方面的测定,对海马蛋白的高效利用提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

海马粉大海马由宁波大学水产养殖基地提供,冻干后,用粉碎机进行粉碎,通过AS200型震筛机过60目筛得到海马粉。海马蛋白(SP)由海马粉经CO2超临界流体萃取技术脱脂后获得。N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(FAPGG)、血管紧张素转换酶(EC:3.4.15.1)、1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)Sigma公司;碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、复合蛋白酶和酸性蛋白酶北京索莱宝科技有限公司;Sephadex G-15Pharmacia公司;无水乙醇、抗坏血酸、硫酸亚铁、体积分数30% H2O2等国药集团化学试剂有限公司。

真空冷冻干燥机美国Labconco公司;DKS-24型电热恒温水浴锅嘉兴市中新医疗仪器有限公司;UB-7型pH计丹佛仪器(北京)有限公司;BS110S型分析天平赛多利斯(北京)教学仪器公司;超滤设备上海朗极有限公司;蛋白层析仪上海沪西青浦仪器有限公司;Tecan Infinite F200/M200型多功能酶标仪 南昌新长征医疗科技发展有限公司;Spe-ed型超临界萃取仪美国ASI公司制造。

1.2实验方法

1.2.1肽的制备

1.2.1.1海马蛋白组分(PH-I)的制备参考Jiang等[9]方法并略加改动,先后用胰蛋白酶和碱性蛋白酶分别酶解脱脂海马粉,酶解液过滤得上清液即为海马蛋白酶解混合溶液;用超滤膜(MWCO为20 ku)进行超滤,收集分子量大于20 ku的滤液,浓缩和冷冻干燥后得海马蛋白粉,即为PH-I。

1.2.1.2酶解PH-I制备ACE抑制肽选用木瓜蛋白酶,菠萝蛋白酶,酸性蛋白酶,复合蛋白酶和风味蛋白酶等5种蛋白酶对PH-I进行再次酶解。取PH-I 0.5 g,加入25 mL蒸馏水,调节水浴锅至每种酶所需要的最佳温度,用0.02 mol/L HCl和0.02 mol/L NaOH溶液进行酸碱调节,底物预热10 min,E/S为4%,酶解6 h后,沸水灭酶活10 min,终止反应。冷却后,以3000 r/min,离心10 min,取上清液备用并冷冻干燥得到多肽粉。取多肽粉分别配成浓度为2、1.6、1.2、0.8和0.4 mg/mL五个梯度溶液,分别用于测量ACE抑制率,求出ACE的半抑制浓度IC50。

1.2.2分析测定

1.2.2.1PH-I和SP氨基酸组成分析送检,送检单位:上海微谱化工技术服务有限公司。样品经酸水解和异硫氰酸苯酯(PITC)衍生化后,将衍生化的氨基酸衍生物通过岛津高效液相色谱仪LC-20A分离检测。

1.2.2.2PH-I中粗蛋白成分的测定参照半微量凯氏定氮法(GB/T 5009.5-2003)。

1.2.2.3水解度(DH%)测定氨基态氮测量方法参照酱油卫生标准的分析方法(GB/T 5009.39-2003),并稍加改进来测定,取酶解液上清液10 mL,加入60 mL蒸馏水,先将pH调制8.20,再利用标准0.0077 mol/L的NaOH溶液进行滴定至pH为9.20,记录所消耗的标准NaOH量。水解度计算公式如下:DH(%)=(h-h0)÷htot×100%=[(V2-V1)×0.0077×0.014×3]÷htot×100%,式中,DH-水解度%;h,h0-分别为实验组和对照组中氨基态氮含量,μg/mL;htot-脱脂海马骨粉原料总氮μg/mL;V2,V1-分别为实验组和对照组所消耗的标准氢氧化钠的体积,mL。

1.2.2.4ACE抑制活性测定参考李莹测定ACE抑制率方法[10]并略作修改,具体方法为:将20 μL多肽溶液和20 μL的ACE溶液(0.1 U/mL水)加入96微孔板的微孔中,但不混合,然后加入130 μL经过预热的底物(1.0 mmol/L FAPGG溶解于50 mmol/L Tris-HCl,pH7.5,包含0.3 mol/L NaCl)使其开始反应。酶标仪温度为37 ℃,在340 nm下每1 min记录一次吸光值,共记录20 min。空白对照使用20 μL的缓冲液(50 mmol/L的Tris-HCl,pH7.5,包含0.3 mol/L NaCl)代替多肽溶液。以吸光值(ΔA340min-1)对时间作出曲线,计算出斜率,取6～15 min的斜率来计算。

ACE抑制率(%)=(1-ΔA抑制率/ΔA空白)×100,半抑制浓度IC50:抑制50% ACE活性时所需样品的浓度。

1.2.3木瓜蛋白酶酶解工艺条优化

1.2.3.1酶解工艺单因素实验以DH%为指标,对影响酶解效果的E/S、温度、pH、时间进行单因素实验。对E/S进行单因素实验:pH7.5,温度55 ℃,酶解时间6 h,E/S分别为2%、3%、4%、5%和6%五个梯度;对时间进行单因素实验,pH7.5,温度55 ℃,E/S 5%,酶解时间分别为1、3、5、7和9 h共5个梯度;对pH进行单因素实验,温度55 ℃,E/S 5%,时间7 h,pH梯度分别为5.5、6.5、7.5、8.5和9.5共5个梯度;对温度进行单因素实验,E/S 5%,时间7 h,pH7.5,温度梯度设置为45、50、55、60和65 ℃共5个梯度。

1.2.3.2响应面优化酶解工艺E/S为4%和5%之间,DH%存在着显著性差异(p<0.05),而5%和6%之间DH%不存在差异(p>0.05),从节约成本的角度考虑,将设定E/S为5%。对时间、pH和温度三因素通过响应面Box-Behnken来进行工艺优化,确定最优酶解工艺,实验因素水平见表1。

表1　木瓜蛋白酶酶解优化的响应面实验设计Table 1　The experimental design for Response surface experimental of Papain

1.2.5PH-I分离纯化产物的抗氧化活性分析在最佳的木瓜蛋白酶酶解PH-I制备ACE抑制肽的条件下,将得到的ACE抑制肽经浓缩和真空冷冻干燥后,用Sephadex G-15分离纯化,得到五个区间组分,采用清除DPPH自由基能力、Fe2+螯合能力和清除羟基自由基(·OH)能力3个指标来评价ACE抑制肽的抗氧化能力,并以BHT,EDTA和维生素C作阳性对照。DPPH自由基清除率的测定方法参照[12];亚铁离子(Fe2+)螯合能力测定方法参照刘建华[13]和Dinis[14];清除羟基自由基(·OH)能力测定方法参照刘建华和涂勇刚[15]。

1.2.6数据处理实验采用Microsoft Excel软件和SAS软件进行数据分析以及图表编辑,Design-Expert 7.0.0软件进行响应面数据分析。若p>0.05,则差异不显著;若p<0.05,则差异显著;若p<0.01,则差异极其显著。

2　结果与分析

2.1PH-I与SP氨基酸组成成分分析

SP和PH-I氨基酸组成如表2。总体上看,PH-I中疏水性氨基酸(74.96%)、支链氨基酸(13.21%)和芳香族氨基酸(4.49%)的含量都略高于SP。一般来说,蛋白质中芳香族氨基酸含量、支链氨基酸含量和疏水性氨基酸含量较高者,蛋白酶解物所表现的ACE抑制率越高[16]。此外,蛋白酶解物的ACE抑制能力与氨基酸的疏水性也呈现出正相关[16]。经观察,SP与PH-I间,疏水值大于10以上的氨基酸(Pro,Ile,Leu,Phe)在PH-I中含量要高于SP,且PH-I相比较于SP,分子量更小,更容易水解成小分子多肽。由此可知,PH-I更适于用来制备ACE抑制肽。刘佳[17]通过比较大豆蛋白与高分子量组分的大豆蛋白(HMF)疏水性氨基酸组成之间的差异,也发现类似结果。

表2　PH-I和SP中的氨基酸组成(%)Table 2　Amino acid compositions of PH-I and SP(%)

式中,疏水性氨基酸:缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)和甘氨酸(Gly),酪氨酸(Tyr);支链氨基酸:缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu);芳香族氨基酸:酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)。

2.2制备ACEIPs最优酶选择结果

在体肠实验中，TPGS-CS/PTX胶束溶液和PTX聚氧乙烯氢化蓖麻油EL-40乙醇（1∶1）溶液相比，前者的载药量大，主药吸收更多。在结肠中Ka较大，而在十二指肠较小，与文献报道[17]不同。实验结果初步表明，TPGS-CS/PTX胶束能提高难溶性药物PTX的生物利用度。进一步的吸收机制研究如黏蛋白吸附、采用香豆素作为荧光探针标记的材料在Caco-2细胞中的摄取等实验也已完成，表明TPGS- CS能使摄取增加。其他机制研究正在进行中。

据报道,ACEIPs的抑制活性主要取决于C端的氨基酸组成,当C端为芳香族氨基酸时(如:Trp、Tyr、Phe、Pro),应选择酸性蛋白酶酶解,产物多肽对ACE酶的抑制活性较强;而当C端残基上有带正电荷的氨基酸存在时(如Lys和Arg),应选择木瓜蛋白酶酶解,产物的抑制活性将显著增强[2]。N端对于抑制ACE活性也有作用,当N端为疏水性氨基酸和支链氨基酸时(包括Val、Ala、Tyr),选择菠萝蛋白酶产物的抑制活性较强[2,18]。然而,对于多肽与ACE酶之间的构效关系还仅仅局限于对已知降血压肽氨基酸序列的定性分析,还有许多降血压肽并不符合上述规律,所以选择复合蛋白酶和风味蛋白酶对于发现新型的ACEIPs具有重要的意义[19]。通过对所选择的5种蛋白酶的酶解液ACEIPs的IC50值的方差分析发现,除了菠萝蛋白酶和风味蛋白酶的IC50值之间没有差异外,其它几种酶的IC50值之间都存在显著差异(p<0.05)。其中,木瓜蛋白酶的IC50值最小为2.028±0.110 mg/mL,所以,选择木瓜蛋白酶作为酶解PH-I制备ACE抑制肽的酶(表3)。

表3　五种酶解液ACEIPs的IC50值Table 3　Values of IC50 of ACEIPs

注:若a,b,c,d字母不相同,表示相互间存在差异显著(p<0.05);若字母相同,表示相互间差异不显著(p>0.05)。

2.3木瓜蛋白酶单因素实验结果

对木瓜蛋白酶酶解PH-I制备ACE抑制肽进行单因素实验,其结果如图1。E/S为5%和6%之间时,差异不显著,是由于E/S为5%已经能够完全的将PH-I水解,所以E/S为6%时的水解度与5%不存在差异(p>0.05),从节约的角度考虑将E/S设置为5%;当酶解时间为7 h,已经完全将PH-I水解,所以与9 h相比,水解度差异不显著(p>0.05)并趋于平缓;当pH为6.5,8.5和9.5时都不是木瓜蛋白酶合适的酸碱度,抑制了酶的活力,所以与pH为7.5相比,水解度差异显著(p<0.05);类似的,温度为60 ℃时,是酶的合适温度,酶解效果最好,与其他梯度间均有显著差异(p<0.05)。因此,木瓜蛋白酶单因素实验的结果为E/S 5%、酶解时间7 h、pH7.5、温度60 ℃。

图1　各因素对木瓜蛋白酶酶解PH-I水解度的影响Fig.1　The impact of various factors on the Papain hydrolysis degree of hydrolysis of the PH-I

2.4响应面优化实验结果

2.4.1PH-I酶解条件分析和优化对酶解时间、pH和酶解温度三因素通过响应面Box-Behnken来进行工艺优化,确定最优酶解工艺,实验结果如表4和表5。

表4　响应面实验表及结果Table 4　The design and results of Response surface experiments

2.4.2方差分析获得木瓜蛋白酶的回归方程:

表5　响应面方差分析Table 5　Analysis the Response surface of variance

注:(a)P-value Prob>F值的大小表示模型及各因素的显著水平;(b)P-value Prob>F值大于0.05表示模型及各因素无显著影响,P-value Prob>F小于0.05表示模型及各因素有显著影响,P-value Prob>F小于0.01表示模型及因素有极显著影响。

DH(%)=-445.704+15.236A+9.615B+12.608C+0.055AB-0.02AC-0.0345 BC-0.965A2-0.518B2-0.1033C2,其中,A、B、C分别表示时间、pH和温度。

由表5方差分析得出,该模型Prob>F(a)值小于0.01,表明本模型是极显著的。失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率,表5中木瓜蛋白酶的模型失拟项的Prob>F(a)值为0.0585大于0.05,模型失拟项不显著,模型选择合适,可以用此模型对PH-I蛋白进行酶解工艺优化。

从回归方程及表5看,AB、AC对木瓜蛋白酶影响不显著,A、C、A2、B2、C2对木瓜蛋白酶有极显著影响,B、BC对木瓜蛋白酶有显著影响。回归方程优化后得:

DH(%)=-445.704+15.236A+9.615B+12.608C-0.0345 BC-0.965A2-0.518B2-0.1033C2,式中,A、B、C分别表示时间、pH和温度。

2.4.3交互作用分析与优化通过Design-Expert软件求解方程,对于木瓜蛋白酶,时间和温度对酶解效果影响均较大,其次为pH。由实验可知,木瓜蛋白酶酶解PH-I的最佳酶解工艺为时间7.5 h、pH7.72、温度59 ℃,预测水解度为20.49%。

图2　酶解温度和pH因素之间相互作用 对木瓜蛋白酶酶解效果的影响Fig.2　The interactions among temperature and pH value in response surface experiment of Papain

2.4.4验证实验PH-I水解度验证:根据响应面优化的最佳工艺条件(E/S 5%,时间7.5 h,pH7.7,温度59 ℃),实测得水解度DH=20.41%±0.12%。略小于预测值20.49%,其误差范围在1%之内。说明PH-I木瓜蛋白酶酶解工艺优化效果较好。

ACEIPs的IC50值的验证:测得ACEIPs的IC50值为1.897±0.072 mg/mL,与优化前的ACEIPs的IC50值为2.028±0.110 mg/mL相比,有着显著的提高(p<0.05)。

2.5PH-I分离纯化后ACE抑制活性分析

选用Sephadex G-15对上述酶解液进行分离,所得5个部分(图3),根据分子筛的原理,这5个区间的分子量大小依次为PH-I1>PH-I2>PH-I3>PH-I4>PH-I5。

图3　PH-I Sephadex G-15蒸馏水洗脱曲线Fig.3　The elution curve of PH-I by water on Sephadex G-15 column chromatography

分别对纯化后的五个部分进行ACE抑制活性分析(图4),经测定PH-I3、PH-I4和PH-I5抑制肽的活性最好,3个区间的IC50值分别为0.896,0.982和0.814 mg/mL。

表6　PH-I分离纯化后各组分的抗氧化能力Table 6　The antioxidant capacity of each segment was isolated by PH-I

图4　各组分的ACE抑制活性分析Fig.4　Elution profile with ACE inhibitory activity of PH-I on Sephadex G-15

2.6PH-I分离纯化后抗氧化能力分析

分离纯化后的5个组分对DPPH自由基的清除能力如表6,PH-I1、PH-I3和PH-I4对DPPH自由基的清除能力较强,分别平均达到64.58%、55.79%和52.28%,与浓度为0.5 mg/mL的人工合成的BHT对DPPH自由基的清除能力较为接近。该能力较其他一些药食同源的品种要强一些,如泰和乌骨鸡活性肽的抗氧化能力,在浓度为1 mg/mL时,对DPPH自由基的清除能力最强为36.7%[15]。

分析Fe2+金属螯合能力,PH-I5和PH-I2与亚铁离子(Fe2+)的螯合能力分别为89.6%和 81.43%,略低于同浓度下EDTA(94.53%)的螯合能力。但比其他生物活性蛋白要高得多,玉米蛋白水解液8 mg/mL对Cu2+的金属螯合能力仅为20%[20],泰和乌骨鸡活性肽对金属离子螯合能力在浓度为1 mg/mL时,与Fe2+的螯合能力为15.4%[15]。

分离纯化后的5个区间多肽对羟基自由基(·OH)的清除能力,除了PH-I2的清除率较高(36.43%)外,其它四个组分对羟基自由基的清除率为11%左右。低于一些报道[21]。这可能是由于提取原料不同及测定方法的差异等造成的。

3　结论

通过分析小分子肽与ACE酶之间的关系并结合酶解后小分子肽抑制ACE能力,筛选出木瓜蛋白酶酶解PH-I;应用响应面法优化了木瓜蛋白酶的酶解工艺,优化后ACEIPs的IC50值为1.897±0.072 mg/mL,与优化前相比较,肽的活力有着显著的提高,这说明了随着水解度的提高,释放出更多的短肽,使得单位质量内的短肽摩尔数增加,从而提高了肽抑制ACE的能力。酶解液经Sephadex G-15分离纯化后,得到五个组分,其中PH-I3、PH-I4和PH-I5的活性最好,IC50分别为0.896,0.982和0.814 mg/mL,具有进一步分离纯化出更高活性肽的意义。

由于自由基的氧化应激反应会对血管照成一定的损伤,促进高血压的患病几率,所以分析多肽的抗氧化能力具有一定的意义。通过分析可知,五个组分的多肽均表现出一定的抗氧化能力,但是每个组分区间对DPPH自由基、羟基自由基、Fe2+的清除率和螯合能力存在着一定的差异。PH-I1对DPPH自由基清除率为64.58%,接近0.5 mg/mL的BHT对DPPH自由基的清除率,明显的强于其它4个组分对DPPH自由基的清除率;PH-I5与Fe2+的螯合能力最强,而PH-I5的分子量最小,小分子肽更加容易暴露活性位点,与Fe2+发生螯合作用;而PH-I2则对羟基自由基的清除率最强;多肽在DPPH自由基、羟基自由基和Fe2+上所表现出的差异,是由于这三个指标与自由基的作用机理之间的差异。所以综合分析小分子肽对ACE的抑制能力和抗氧化能力,PH-I3、PH-I4和PH-I5适合进一步的分离纯化并进行深入的研究,这对于功能性食品肽在高血压方面的应用具有一定的指导意义。

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Preparation ofHippocampusACE inhibitory peptide and determination of antioxidant capacity

GU Wei,XU Yong-jian*

(School of Marine Sciences,Ningbo University/Key Laboratory for Applied Marine Biotechnology of Ministry of Education,Ningbo 315211,China)

In order to preparation ACE inhibitory peptide fromHippocampusand determination antioxidant capacity,this article compare the relationship between the peptide and ACE,the Papain were selected out from 5 proteases to hydrolyse seahorse protein. On the basis of single-factor experiments,the key parameters of Papain were optimized by Response Surface Method for preparation ACE inhibitory peptides,the operating conditions were:enzyme to substrate(E/S)ratio of 5%,hydrolysis time of 7.5 h,pH of 7.7,hydrolysis temperature of 59 ℃;under this condition,the degree of hydrolysis(DH%)was 20.41%±0.12%,ACE inhibitory activity of IC50was 1.897±0.072 mg/mL. The hydrolyzate was divided into five fractions through Sephadex G-15,where component 3(PH-I3),component 4(PH-I4)and component 5(PH-I5)had good activity and the IC50of each fraction was 0.896 mg/mL,0.982 mg/mL and 0.814 mg/mL;the anti-oxidation experiments of five fractions,the components can scavenging DPPH.,hydroxyl radicals and chelating with the Fe2+significantly. Therefore,the PH-I prepared ACE inhibitory peptides both hypotensive and antioxidant functions,which had great significance in the development of functional foods.

Hippocampus;ACE inhibitory peptides;antioxidant capacity;Papain

2015-08-04

顾伟(1990-),男,硕士研究生,研究方向:食品工程,E-mail:1239156290@qq.com。

徐永健(1975-),男,博士,教授,研究方向:海洋生物资源开发与利用,E-mail:xuyongjian@nbu.edu.cn。

中国国家自然科学基金资助(41276123)；国家星火项目计划的支持(2012GA701048)。

TS218

B

1002-0306(2016)05-0201-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.031