5种黑穗醋栗果实中糖酸组成与含量分析

李　贺,李歆昕,陆　璐,柯筱纯,阮成江

(大连民族大学环境与资源学院,辽宁大连 116600)



5种黑穗醋栗果实中糖酸组成与含量分析

李贺,李歆昕,陆璐,柯筱纯,阮成江*

(大连民族大学环境与资源学院,辽宁大连 116600)

采用高效液相色谱法对5个品种黑穗醋栗果实的主要糖酸组分进行定性和定量分析,并计算甜度和甜酸比。结果表明,黑穗醋栗果实中糖组分包括果糖、葡萄糖、蔗糖,其中以果糖(19.03～32.74 mg/g)和葡萄糖(17.47～23.21 mg/g)为主;黑穗醋栗果实中有机酸组分包括草酸、奎宁酸、苹果酸、维生素C、柠檬酸等,其中以柠檬酸(19.16～24.33 mg/g),维生素C(2.53～8.80 mg/g),苹果酸为主(0.92～2.27 mg/g)。不同品种黑穗醋栗果实中的糖酸组成及含量存在一定的差异,果糖和葡萄糖含量最高的品种为寒丰,柠檬酸含量最高的品种为奥依宾,苹果酸和维生素C含量最高的品种为寒丰。甜度/总酸值是影响黑穗醋栗果实甜酸风味的一个重要因素。各品种甜度/总酸值在179.23～261.01之间,总体表现为寒丰>丹丰>绥研1号>黑丰>奥依宾。

黑穗醋栗(RibesnigrumL.),高效液相色谱,糖,有机酸,甜度/总酸

黑穗醋栗(RibesnigrumL.)俗称黑加仑,虎耳草科茶藨子属落叶直立灌木,抗寒性强、色泽好、风味独特,是极具寒地特色的小浆果树种[1]。果实富含维生素C、花青素等营养成分[2],可鲜食。作为黑穗醋栗果实中的主要风味物质,可溶性糖和有机酸直接影响果实的甜酸风味和口感,是衡量果实品质的重要指标[3-5]。因此,研究糖、酸风味物质的组成与含量及其对果实风味品质形成的影响,对于黑穗醋栗品质评价及其相关食品、饮料的加工具有重要意义。

国内外有较多关于植物果实糖酸组分分析的报道[6-10],但是关于黑穗醋栗果实糖酸组分及含量的研究报道不多,Kampuss[11]曾对黑穗醋栗等三种浆果进行了糖、酸、维生素C等组分的分析,Jasminka等[12]连续三年对种植在塞尔维亚共和国的3个黑穗醋栗品种进行了糖、酸的测定,研究发现不同品种的黑穗醋栗果实糖酸含量存在较大差异。国内至今还未见黑穗醋栗果实糖、酸组成及含量分析的相关报道,亟待对我国黑穗醋栗品种进行此方面的研究,揭示不同品种果实在糖、酸组成及含量上的差别,及其对风味品质的影响。本研究以5个黑穗醋栗品种为试材,采用高效液相色谱法(HPLC)对果实糖、酸组分和含量进行了分析,比较了不同黑穗醋栗品种果实甜酸风味的差异,在考虑不同糖组分对果实甜度产生不同影响的基础上,综合评价了5个黑穗醋栗品种的甜酸风味,以期为黑穗醋栗品质评价、品种改良提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

供试的5个黑穗醋栗品种(奥依宾,绥研1号,丹丰,黑丰,寒丰)的成熟果实于2014年7月采自黑龙江省农业科学院浆果研究所黑穗醋栗材料圃,实验室中-20 ℃长期保存。果糖、葡萄糖、蔗糖、奎宁酸、L-苹果酸、维生素C、柠檬酸标准品和磷酸二氢钾(KH2PO4,色谱级,≥99.5%)Sigma-Aldrich(中国)公司;草酸标准品德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈和甲醇(均为色谱纯级)美国Honeywell Burdick & Jackson公司;二硫苏糖醇(DTT,≥99%)德国Merk公司;偏磷酸国药集团化学试剂有限公司。

Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪及工作站美国Agilent公司;SB52000型超声波清洗仪宁波新艺超声设备有限公司;PL203型电子天平瑞士METTLER TOLEDO公司;H2100R型高速冷冻离心机湖南湘仪离心机仪器有限公司;AD200L-P型分散匀质机上海昂尼仪器仪表有限公司。

1.2实验方法

1.2.1样品处理准确称取2 g冻果于50 mL离心管中,加入2 mL提取液(酸提取液:2%偏磷酸,含0.1% DTT,下同;糖提取液:超纯水,下同),匀浆30 s,漩涡混合1 min,室温水浴超声2 min,4 ℃下15000×g离心15 min,取上清液到10 mL离心管中,残渣中加入1 mL提取液再提取,合并上清液,用提取液定容至5 mL,经0.22 μm滤膜过滤后备用。糖待测液样品在上机前用超纯水稀释2～3倍。

1.2.2标准溶液的配制准确称取果糖、葡萄糖标准品各500 mg,蔗糖标准品200 mg混合定容于10 mL容量瓶,得到果糖50 mg/mL、葡萄糖50 mg/mL、果糖20 mg/mL的混标母液,用超纯水稀释糖混标母液,得到果糖和葡萄糖浓度为10.00,4.00,2.50,1.25,1.00,0.50 mg/mL,蔗糖浓度为6.00,2.40,1.50,0.75,0.60,0.30 mg/mL的一系列糖混标溶液。准确称取草酸20 mg、奎宁酸40 mg、苹果酸50 mg、维生素C 250 mg、柠檬酸500 mg,混合定容于10 mL容量瓶,得到草酸2 mg/mL、奎宁酸4 mg/mL、苹果酸5 mg/mL、维生素C 25 mg/mL,柠檬酸50 mg/mL的有机酸混标母液,用超纯水稀释有机酸混标母液,得到草酸浓度为0.40,0.20,0.16,0.10,0.08,0.05 mg/mL,奎宁酸浓度为0.80,0.40,0.32,0.20,0.16,0.10 mg/mL,苹果酸浓度为1.00,0.50,0.40,0.25,0.20,0.125 mg/mL,维生素C浓度为5.00,2.50,2.00,1.25,1.00,0.625 mg/mL,柠檬酸浓度为10.00,5.00,4.00,2.50,2.00,1.25 mg/mL的一系列有机酸混标溶液。

1.2.3高效液相色谱条件糖组分的液相色谱条件:RID示差检测器,色谱柱:Zorbax Carbohydrate Analysis column(250 mm×4.6 mm,5 μm,Agilent),流动相为乙腈∶水=7∶3,流速0.7 mL/min,柱温30 ℃,检测池温度35 ℃,进样量20 μL。

有机酸测定的液相色谱条件:DAD二极管阵列检测器,色谱柱:Shim-pack VP-ODS column(250 mm×4.6 mm,5 μm,Shimadzu),带C18保护柱(4× 3.0 mm),流动相:40 mmol/L KH2PO4(含0.1% DTT),流速为0.4 mL/min,柱温35 ℃,进样量 20 μL。维生素C检测波长245 nm,其它有机酸检测波长208 nm。

1.2.4糖、酸测定的可行性

1.2.4.1线性关系和重复性的考察对浓度分别为0.30～10.00 mg/mL和0.05～10.00 mg/mL的糖、酸混合标准溶液进行HPLC分析,对各测得值进行相关关系分析,并拟合线性回归方程;测定6份平行处理得到的样品,计算测定结果的相对标准偏差(RSD),以考察实验方法的重复性。

1.2.4.2回收率的测定对回收率的测定本研究采用加标回收法[13]。精确量取已知质量浓度的同一样品提取液3份,加入不同质量浓度的糖组分单标标样,使得每种糖组分质量浓度均增加1 mg/mL;另取5份已知质量浓度的同一样品提取液,分别加入不同的有机酸组分单标标样,使5种有机酸(草酸、奎宁酸、苹果酸、维生素C、柠檬酸)的质量浓度分别增加0.05,0.05,0.20,0.50,1.00 mg/mL。根据加入标准品的质量浓度和检出质量浓度计算回收率。

1.2.4.3确定出峰时间在基本一致的外界环境下(如温度、湿度等),将标样和样品的待测液在相应的色谱条件下进行分析,考察出峰时间(每次实验前先测定混标以确定当天的实验条件下各组分的出峰时间)。

1.2.55个黑穗醋栗品种果实糖、酸组分及其含量的测定按照1.2.1项下方法制备样品溶液并适当稀释,按照1.2.3项下方法进样,用外标法计算各物质含量,每个样品重复3次。

1.2.6甜度计算甜度的计算参照梁俊等[13]和姚改芳等[14]的方法。将蔗糖甜度定为100,以此为标准进行甜度对比,则果糖为175,葡萄糖为70,甜度值=果糖含量×175+葡萄糖含量×70+蔗糖含量×100。

1.2.7果实甜酸风味的评测参照赵尊行等[15]的方法,用甜度/总酸值来评测果实风味。感官评价:将果实切成多个小块,邀请10位测试者进行品尝,对果实的甜酸风味打分。口感评价分为三个等级:偏甜(记3分)、甜酸(记2分)和偏酸(记1分),以口感得分平均值作为感官评价的最终得分。

表1　糖测定的线性回归方程的相关性和重复性Table 1　Linearity and repeatability determination of sugars

注:回归方程中X代表糖质量浓度,Y代表峰面积。

表2　有机酸测定的线性回归方程的相关性和重复性Table 2　Linearity and repeatability determination of organic acids

注:回归方程中X代表有机酸质量浓度,Y代表峰面积。

1.3数据处理

实验数据采用SPSS22.0进行平均数、相对标准偏差和多重比较分析。

2　结果与分析

2.1糖,酸含量测定的可行性

2.1.1线性关系与重复性如表1和表2所示,三种糖的线性回归方程的相关系数为0.9902～0.9970;五种有机酸的线性回归方程的相关系数为0.9906～0.9985,表明在设定的高效液相色谱条件下各种糖、酸组分的峰面积与其含量有较好的线性相关性,实验方法能在给定的浓度范围内较准确地测定糖、酸组分的含量。6份平行处理的样品经分析测定,糖、酸组分的相对标准偏差分别为2.34%～4.80%和0.04%～4.64%,说明HPLC方法具有较好的重复性,达到了分析的要求。

2.1.2回收率如表3和表4所示,糖、酸组分的加标回收率分别在92.39%～102.26%和92.22%～104.62%之间,相对标准偏差均小于4%,回收率较高,相对标准偏差较小,满足分析测试的需要。

表3　糖测定的回收率Table 3　Recoveries of sugars determination

表4　有机酸测定的回收率Table 4　Recoveries of organic acids determination

2.1.3出峰时间图1和图2分别为糖混合标准品和黑丰果实中糖组分的液相色谱图,如图所示,所有糖组分在15 min内出峰完毕。样品中糖组分的组成较简单,只含有与糖标准品相同的3种糖组分,且均被很好地分离开来。图3和图4分别为有机酸混合标准品和丹丰果实中有机酸组分的液相色谱图,如图所示,所有有机酸组分在18 min内出峰完毕。样品中有机酸酸组分的组成较为复杂,除有机酸标准品中的5种酸以外还含有个别未知酸且与几种已知酸组分的出峰时间极为相近,难以完全分离,但黑穗醋栗中三种主要的有机酸组分,柠檬酸、维生素C和苹果酸都能够被较好的分离。

图1　糖混合标准样品的色谱图Fig.1　Chromatogram of mixture standard of sugars注:1.果糖;2.葡萄糖;3.蔗糖。

图2　黑丰果实糖组分色谱图Fig.2　Chromatogram of sugar components in Heifeng注:1.果糖;2.葡萄糖;3.蔗糖。

图3　有机酸混合标准样品的色谱图Fig.3　Chromatogram of mixture standard of organic acids注:1.草酸;2.奎宁酸;3.苹果酸; 4.维生素C;5.柠檬酸,图4同。

图4　丹丰果实有机酸组分的色谱图Fig.4　Chromatogram of organic acid components in Danfeng

2.25种黑穗醋栗果实中糖组分及其含量

如表5所示,不同黑穗醋栗品种果实中糖组分组成基本相同,但含量上有差异,果糖含量19.03～32.74 mg/g,葡萄糖含量17.47～23.21 mg/g,蔗糖含量4.55～10.56 mg/g。果糖、葡萄糖、蔗糖均为黑穗醋栗果实中的主要糖组分,但蔗糖含量相对偏低,含量上总体表现为:果糖>葡萄糖>蔗糖。在5个品种中,总糖含量表现为:寒丰>丹丰>绥研1号>黑丰>奥依宾;果糖含量表现为:寒丰>绥研1号>丹丰>奥依宾>黑丰;葡萄糖含量表现为:寒丰>绥研1号>丹丰>奥依宾>黑丰;蔗糖含量表现为:黑丰>寒丰>丹丰>绥研1号>奥依宾。

不同糖组分在不同品种总糖中所占比例表现为,果糖占总糖比最高的品种为绥研1号(51.51%),最低的为黑丰(40.44%);葡萄糖占总糖含量的比例最高的为奥依宾(39.24%),最低的为寒丰(35.78%),蔗糖占总糖比例最高的为黑丰(22.44%),最低的为绥研1号(9.63%)。寒丰品种果实中果糖和葡萄糖含量均最高,分别为32.74、23.21 mg/g;黑丰品种蔗糖含量最高为10.56 mg/g(表5)。

表5　5个黑穗醋栗品种的果实中糖组分及含量(mg/g)Table 5　Contents of sugar components in 5 blackcurrant cultivars(mg/g)

注:同列数据后不同大写字母表示差异显著(p<0.05),表6同。

2.35种黑穗醋栗果实的甜度

由于不同种类的糖甜度不同,对果实口感的影响也不同,所测得的3种糖中,果糖最甜,蔗糖其次,葡萄糖甜度最低[14]。测得的三种糖在黑穗醋栗中所含的比例不同,因此不能用总糖含量来反映整体的甜味,而应根据不同糖种类的不同甜度计算出的其整体甜度值进行判断。例如,由表5可知总糖含量上黑丰高于奥依宾,但由于奥依宾中的果糖含量比黑丰高,使得黑丰的甜度比奥依宾低。5种黑穗醋栗果实的甜度值表现为:寒丰>丹丰>绥研1号>奥依宾>黑丰。甜度值分布在5000～6000的品种2个,分别是奥依宾和黑丰;甜度值在6000～7000的品种2个,分别是绥研1号和丹丰;甜度值>7000的品种只有1个,即寒丰。

表6　5个黑加仑品种的果实中有机酸组分及含量(mg/g)Table 6　Contents of organic acid components in 5 blackcurrant cultivars

2.45种黑穗醋栗果实中有机酸组分及其含量

从有机酸的混合标准样品出峰情况可看出,在设定的色谱条件下(维生素C的检测波长为245 nm,其余酸组分被检测波长为208 nm),各种有机酸分离效果较好,峰形对称;但从样品的出峰效果来看,草酸峰和奎宁酸峰与邻峰有连峰现象,其它3种酸分离情况较好,峰形也较对称。从样品出峰结果还能发现黑穗醋栗果实中在208 nm波长下可检成分比较复杂,可能是由于高浓度的色素干扰或是其它含量较少的酸。如表6所示,不同黑穗醋栗品种的果实中有机酸组分组成基本相同,以柠檬酸为主(60.67%～81.43%),其次是维生素C(8.98%～27.87%)和苹果酸(3.54%～7.19%),草酸和奎宁酸含量偏低,占总酸比例均低于5%。在5个品种中,总酸含量表现为奥依宾>寒丰>丹丰>绥研1号>黑丰;柠檬酸含量表现为奥依宾>绥研1号>丹丰>黑丰>寒丰;维生素C含量表现为寒丰>奥依宾>丹丰>黑丰>绥研1号。5个黑穗醋栗品种中,奥依宾品种果实中的柠檬酸含量最高,为24.33 mg/g;寒丰品种果实中的苹果酸和维生素C含量均最高,分别为2.27 mg/g和8.80 mg/g。

2.55种黑穗醋栗实的风味比较

关于果实风味的研究有人认为主要取决于总糖,总酸的含量和糖酸比[16-18],但由于总糖含量并不能反映果实的真实甜度,所以本研究参考梁俊等[13]的观点,用甜度/总酸值来反映黑穗醋栗果实的风味,实际的口感评价结果符合甜度/总酸值反映的结果。5个黑穗醋栗品种的甜度/总酸值(表6)表现为寒丰>丹丰>绥研1号>黑丰>奥依宾,果实的口感表现出的规律与甜度/总酸值相同,寒丰的口感偏甜,丹丰、绥研1号和黑丰为甜酸风味,奥依宾口感偏酸,其中奥依宾的总甜度(5689.04)高于黑丰(5607.86),但口感较黑丰偏酸,就是由于奥依宾的总酸含量(31.74 mg/g)高于黑丰(26.10 mg/g),使奥依宾的甜度/总酸值小于黑丰。因此,本研究认为甜度/总酸值是影响黑穗醋栗果实风味的重要因素。

3　讨论

通过对5种黑穗醋栗的研究,发现其果实中主要的糖组分为果糖、葡萄糖,主要的有机酸组分有柠檬酸、苹果酸,这与Jasminka等[12]的研究结果一致,但本研究发现5个黑穗醋栗品种中柠檬酸的平均含量(21.72 mg/g)远远大于苹果酸(1.58 mg/g),而Jasminka等分析的3个品种中二者相差不大且含量较低,说明不同地区黑穗醋栗品种间的活性成分含量存在很大差异。本研究5个品种中寒丰的果糖、葡萄糖和蔗糖含量最高,甜度/总酸值最大,口感最甜,奥依宾总糖和甜度最低,总酸最高,甜度/总酸值最小,口感偏酸,品种间在糖酸的组成和含量上存在一定的差异。已有研究认为黑穗醋栗的种间及品种间的差异与基因型(遗传因素),降水量(气候因素)以及果实的成熟度等有关[12,19],本研究的材料来自同一生长地,气候等环境因素相似,且于成熟期采集,因此推测品种的遗传特性是主要因素,但这一推测有待进一步研究。

另外,本研究发现黑穗醋栗果实中除了柠檬酸和苹果酸,还存在草酸,奎尼酸和含量较高的维生素C,前两者在以往的文献中还未见报道。本研究中测得的各品种果实维生素C的平均含量为4.56 mg/g,高于刘洪章等[20]在亮叶,黑珍珠和新宾三个品种中测得的维生素C含量(最高为1.58 mg/g),这说明黑穗醋栗有机酸的组成及含量在品种间的差异有待深入研究。

果实风味品质的形成是糖、酸以及挥发性芳香物质等多种成分共同作用的结果,其中糖、酸的组成及其含量起主要作用。黑穗醋栗中很多种物质影响果实的风味,但其口感主要受糖、酸组分及含量的影响,并且不同糖组分对甜味的影响程度不同,因此并不能由总糖含量或是总糖/总酸含量来判断果实的口感,而应用甜度/总酸值来反映果实甜酸风味。例如,黑丰品种的甜度虽然低于奥依宾,但其总酸值相对奥依宾品种也更低,所以黑丰的甜度/总酸值高于奥依宾,相应的口感也偏甜。因此,本研究认为对于黑穗醋栗来说,甜度/总酸值是影响和反映果实口感的重要因素和指标。

4　结论

黑穗醋栗果实中的糖组分有果糖、葡萄糖、蔗糖;有机酸组分有草酸、奎尼酸、苹果酸、维生素C、柠檬酸,不同品种在糖、酸的组成及含量上存在一定的差异。本研究中5种黑穗醋栗果实中糖主要成分为果糖和葡萄糖,二者含量平均约占总糖含量的86.06%,有机酸主要成分为柠檬酸,其含量平均约占总酸含量的74.53%,其次为维生素C、苹果酸,二者含量平均约占20.59%。甜度/总酸值是影响黑穗醋栗果实甜酸风味的重要因素,5个品种中甜度/总酸值最高的品种是寒丰(>260),最低的是奥依宾(<200),其余3个品种甜度/总酸值在210～230之间。

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Analysis of contents and constituents of sugar and organic acid in 5 black currant cultivars

LI He,LI Xin-xin,LU Lu,KE Xiao-chun,RUAN Cheng-jiang*

(College of Environment and Resources,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China)

The primary sugars and organic acids of five blackcurrant cultivars were analyzed quantitatively and qualitatively by HPLC(High Performance Liquid Chromatography)method,and the sweetness and sweetness/total acids were calculated. The results indicated that the soluble sugars in blackcurrant berries included fructose,glucose and sucrose,of which fructose(19.03～32.74 mg/g)and glucose(17.47～23.21 mg/g)were much more than sucrose. The organic acid components in blackcurrant included oxalic acid,quinic acid,malic acid,vitamin C and citric acid,of which citric acid(19.16～24.33 mg/g),vitamin C(2.53～8.80 mg/g)and malic acid(0.92～2.27 mg/g)were much more than others. There were some differences in composition and content of sugar and organic acid among five black currant varieties. Hanfeng exhibited the highest levels of fructose and glucose in comparison to the other cultivars. The berries of Aoyibin contained highest citric acid in all the cultivars. Vitamin C and malic acid were richest in berries of Hanfeng. The value of sweetness/total acids was an important indicator influencing the sweet and sour flavors of black currant fruit. The sweetness/total acids was from 179.23 to 261.01,and Hanfeng>Danfeng>Suiyan 1st>Heifeng>Aoyibin.

black currant(RibesnigrumL.);HPLC;sugars;organic acids;sweetness/total acids

2015-08-27

李贺(1975-)，女，博士研究生，副教授，研究方向：植物成分分析，E-mail:lihe@dlnu.edu.cn。

阮成江(1972-)，男，博士，教授，研究方向：植物代谢组学，E-mail:ruan@dlnu.edu.cn。

国家自然科学基金(31100489)；大学生创新创业训练计划(X201412236)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)05-0137-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.018