羧甲基壳聚糖包覆薏苡仁油前体脂质体的稳定性研究

白春清,熊　华,陈丽丽,袁美兰,江　勇,赵　利,*

(1.江西科技师范大学 生命科学学院,江西南昌 330013;2.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047)



羧甲基壳聚糖包覆薏苡仁油前体脂质体的稳定性研究

白春清1,熊华2,陈丽丽1,袁美兰1,江勇1,赵利1,*

(1.江西科技师范大学 生命科学学院,江西南昌 330013;2.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047)

为评价羧甲基壳聚糖包覆薏苡仁油前体脂质体(CM-PL)的贮藏稳定性及复水稳定性,本研究以贮藏过程中薏苡仁油(CSO)渗漏率、丙二醛(MDA)生成量为主要指标系统考察了CM-PL在不同贮藏条件下的贮藏稳定性;以CSO渗漏率为指标考察了氯化钠溶液、葡萄糖溶液对CM-PL复水稳定性的影响。结果表明:光照、高温以及空气接触均影响CM-PL的稳定性,其影响顺序为温度>空气>光照;其中温度升高可提高芯材渗漏量,加速脂质氧化;贮藏初期,光照组及空气接触组与对照组相差不大,可能与羧甲基壳聚糖能在一定程度上延缓体系的光致氧化及自氧化进程有关,但其保护作用有限,因此 CM-PL 应真空、避光、低温贮藏;复水稳定性结果显示CM-PL对氯化钠的耐受性高于葡萄糖,与二者共存贮藏14 d后CSO渗漏率分别为14.3%,21.1%。

羧甲基壳聚糖,薏苡仁油,前体脂质体,稳定性

薏苡仁油是薏苡仁中提取的脂溶性成分,具有降血压、降血糖、抗肿瘤等生理功能,但其水溶性差,含大量的不饱和脂肪酸(超过80%),易氧化分解[1]。脂质体是以磷脂等两亲性材料为膜材,分散在水中自发形成的具有类细胞膜脂质双分子层结构的封闭囊泡[1-2]。可包埋油溶性成分[3],提高其稳定性及水溶性[4-5]。但常规脂质体属于液态体系,长期存放易发生聚集、分层、包埋物渗漏等问题[6-8]。为了解决上述问题,白春清等[9-11]采用乙醇注入法结合聚合物修饰技术及喷雾干燥技术,成功制备了羧甲基壳聚糖包覆薏苡仁油前体脂质体。正如常规产品,前体脂质体在真正达到消费者手中之前要经过较长的贮存期[5],而适宜的贮存条件是影响产品稳定性的关键因素,但此方面缺乏系统的研究。因此,为保证前体脂质体在应用时能有较好的质量状态,考察前体脂质体在贮存期间的稳定情况及其影响因素,以确定较合理的贮藏条件显得十分必要。此外,前体脂质体无论是口服给药还是注射给药都存在复水以及与其他成分共存的状况,在该条件下良好的稳定性是载药纳米颗粒的必备条件之一,而此方面的研究鲜有报道[12]。

因此,本研究以贮藏过程中薏苡仁油的渗漏率及脂质(磷脂,薏苡仁油)氧化终产物丙二醛为指标,综合考察了主要环境因素(温度、光照、空气)对产品稳定性的影响,确定较合理的贮藏条件,同时以氯化钠注射液、葡萄糖注射液为代表考察其他成分对前体脂质体稳定性的影响,评价其复水稳定性,为拓展前体脂质体的应用奠定基础。

1　材料与方法

蛋黄卵磷脂(磷脂酰胆碱>98%)沈阳仙峰科技发展有限公司;胆固醇上海蓝季科技发展有限公司;薏苡仁油广州合诚三仙生物科技有限公司;羧甲基壳聚糖、硫代巴比妥酸上海晶纯试剂有限公司;磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸、石油醚、无水乙醇国药集团化学试剂有限公司。以上试剂皆为分析纯。

THZ-82恒温振荡器常州国华电器有限公司;超声波发生器上海科导超声仪器有限公司;YC-015实验型喷雾干燥机上海雅程仪器设备有限公司;紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司;RCZ-6B3型药物溶出度仪上海黄海药检仪器有限公司;RGX-150人工气候培养箱四川中浪科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1CM-PL的制备按照白春清等[12]所报道的方法制备羧甲基壳聚糖包覆脂质体,以进、出风温度分别为190、95 ℃进行喷雾干燥,制备CM-PL。

1.2.2渗漏率的测定渗漏率可反映脂质体的包封率在贮存期间的变化。在贮藏过程中,定期取样0.2 g于100 mL试管中,加40 mL蒸馏水,室温振荡水化10 min制备羧甲基壳聚糖包覆脂质体复原液,并取10 mL复原液于透析袋中,以磷酸盐缓冲液为介质释放17 h后,采用透析与紫外相结合的方法测定并计算包封率,具体操作参照白春清等[11]的方法。按下式计算渗漏率。

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1.2.3丙二醛的测定根据卵磷脂及薏苡仁油氧化终产物丙二醛可在酸性条件下与硫代巴比妥酸反应生成红色产物(TBA-pigment),该产物在532 nm波长处有特异吸收。通过测定体系中MDA的生产量可间接反映体系的氧化程度。具体操作参照xia等[13]的方法。

1.2.4温度对CM-PL稳定性的影响将CM-PL装入铝箔袋中,进行真空密封后,分别置于4 ℃冰箱、25 ℃人工气候培养箱及45 ℃人工气候培养箱下避光保存,于0、10、20、30、40、50、60 d分别取样0.2 g,分别按照1.2.2及1.2.3的方法测定产品的CSO渗漏率和MDA值。

1.2.5光照对CM-PL稳定性的影响将CM-PL分别装入透明袋和铝箔袋中,进行真空密封后,置于人工气候培养箱中,于温度为25 ℃,黑夜白天交替间歇光照条件下贮藏60 d,于0、10、20、30、40、50、60 d分别取样0.2 g,按照1.2.2及1.2.3的方法测定产品的CSO渗漏率和MDA值。

1.2.6空气对CM-PL稳定性的影响将铝箔袋真空包装的CM-PL及敞口包装的CM-PL置于25 ℃人工气候培养箱中避光贮藏60 d,于0、10、20、30、40、50、60 d分别取样0.2 g,按照1.2.2及1.2.3的方法测定产品的CSO渗漏率和MDA值,考察空气对CM-PL稳定性的影响。

1.2.7氯化钠、葡萄糖溶液对CM-PL稳定性的影响以9 g/L氯化钠溶液、50 g/L葡萄糖溶液为分散液采用1.2.2中所描述的方法进行复水,制备羧甲基壳聚糖包覆薏苡仁油脂质体混悬液,将其装入试管中,常温放置2周,定期取样,观察样品外观,并测定其在与食物成分共存期间CSO的渗漏率。

1.3数据的统计处理

实验数据采用SPSS 12.0软件进行统计分析,数值以3次实验的均值±标准偏差表示,选取α=0.05进行显著性分析。

2　结果与讨论

2.1温度对CM-PL稳定性的影响

对于一般包埋油脂类产品而言,油脂的存在形式主要包括两个方面:被包埋的油脂和未被包埋的油脂(表面油),由于囊膜的保护作用,表面油的氧化速度通常快于被包埋油脂的氧化速度。而温度对该类产品稳定性的影响主要源于两个方面:一方面温度升高会提高囊膜的通透性,加速芯材的渗漏;另一方面,高温会加速油脂的氧化产生大量的氧化产物。如图1、图2所示,随着存放时间的延长,所有样品的CSO渗漏量及MDA值都有所增加,且高温组的升高速度快于低温组。图1显示CM-PL于4、25、45 ℃分别放置60 d后,CSO渗漏率分别为0.81%、12.38%、80.34%,即温度越高,芯材渗漏量越大,这可能是因为温度升高会提高脂质体膜及羧甲基壳聚糖层通透性,加速芯材的渗漏。图2显示,CM-PL经不同温度下放置60 d后,MDA值分别为10.95、11.87、27.29 ng/mg PC,即温度越高体系的氧化产物越多,氧化程度越高,同时也说明高温在提高芯材渗漏量的同时,加速了脂质氧化。

图1　温度对CM-PL贮藏期间渗漏率的影响Fig.1　The influence of temperature on the leakage ratio of CM-PL during storage

图2　温度对CM-PL贮藏期间MDA值的影响Fig.2　The influence of temperature on the MDA value of CM-PL during storage

2.2光照对CM-PL稳定性的影响

由图3、图4可以看出随着存放时间的延长所有样品的MDA值、CSO渗漏率都有所增加,且光照组测定值普遍高于对照组,但二者的变化趋势较为相似。在样品放置的最初10 d内,CSO渗漏率和MDA值增长缓慢,且实验组与对照组的测定值相差不大。这可能是因为在放置初期,CM-PL的包封率较高,即黏附在羧甲基壳聚糖层外的CSO较少,由于存放时间较短,油脂氧化产生的初级产物较多,而实验中所测定的氧化终产物-MDA较少;另一方面,羧甲基壳聚糖可能不易受光照的影响,当未包埋的薏苡仁油被氧化后,被包埋的薏苡仁油由于受羧甲基壳聚糖层及磷脂双分子层的双重保护,氧化及渗漏速度较为缓慢。但随着存放时间的延长,CSO渗漏量增多,并在羧甲基壳聚糖层中溶出脂溶性通道,使CSO渗漏加速,外加光致氧化作用,光照组的MDA值及CSO渗漏率在贮藏后期明显高于对照组。但对照组放置60 d后,CSO保留率仍高于85%,表明所制备的前体脂质体稳定性较好。同时也说明虽然该剂型可在一定程度上提高芯材及常规脂质体的稳定性,但对光照的缓冲作用有限,CM-PL应尽量避光保存。

图3　光照对CM-PL贮藏期间渗漏率的影响Fig.3　The influence of light on the leakage ratio of CM-PL during storage

图4　光照对CM-PL贮藏期间MDA值的影响Fig.4　The influence of light on the MDA value of CM-PL during storage

2.3空气对CM-PL稳定性的影响

避光放置的油脂样品易发生自氧化,该类型氧化易受空气中的氧气、微生物等因素的影响产生自由基,使体系进入油脂氧化的引发期,进而引发脂质氧化,转入链传递期,直至氧化终止产生大量的MDA。虽然体系中绝大多数薏苡仁油被CM-PL包埋,但微量的未包埋油脂,在受到空气中的氧及其他不利因素的长期作用下引发自动氧化,产生的自由基,而其又成为油脂继续氧化的诱因,导致未氧化的薏苡仁油及磷脂发生快速氧化。

图5　空气对CM-PL贮藏期间渗漏率的影响Fig.5　The influence of atmosphere on the leakage ratio of CM-PL during storage

如图6所示避光敞口放置CM-PL的MDA值在放置初期增长缓慢,而后快速升高。一方面,由于油脂氧化进入引发期需要一定的时间,另一方面可能与羧甲基壳聚糖有一定的阻氧性有关[14]。在放置初期由于羧甲基壳聚糖层对氧气的选择不透过性,在一定程度上延缓了自氧化的引发期,但由于保护作用有限,随着放置时间的延长,不能对进入链传递期的快速氧化阶段发挥明显抑制的作用,导致后期MDA值升高较快。而对照组由于处于避光、真空状态几乎不受任何环境因素的影响,氧化较为缓慢。同时也可发现,敞口组虽然稳定性相对较差,但氧化程度不大,保存60 d后MDA值由9.30 ng/mg PC升为22.56 ng/mg PC,而CSO渗漏率小于20%,表明产品稳定性较好。但为了延长货架期,保证食用安全,在样品贮存期间还应尽量采用真空避光保存。

图6　空气对CM-PL贮藏期间MDA值的影响Fig.6　The influence of atmosphere on the MDA value of CM-PL during storage

2.4环境因素对CM-PL稳定性的综合影响

外界环境是一个复杂的系统,存在大量对产品稳定性不利的因素,且影响作用较为复杂。一方面,不同性质的产品,在相同贮藏环境下,稳定性存在差异;另一方面,单个环境因素的变动,也会对同一产品产生不同的影响。实验拟通过考察三个主要环境因素(温度、光照、空气)对CM-PL存放期间MDA值及CSO渗漏率的综合影响,找出影响较大的环境因素,以期为CM-PL的合理贮存提供参考。

如图7、图8所示,D样品的MDA值及CSO渗漏率升高最快,C样品次之,B样品第三,A样品最小,即对CM-PL的影响顺序为温度>空气>光照。由于C、D样品皆在避光条件下存放,体系都发生油脂自氧化,但稳定性存在差异。在整个研究时间段内D样品的渗漏率明显高于C样品;在MDA值方面,10 d时D样品的MDA值低于C样品,20 d时与C样品相当,>20 d则前者的测定值显著高于后者。放置初期,由于在高温的影响下,虽然D样品的CSO渗漏量>C样品,但由于前者处于真空避光条件下,几乎不受其它因素的影响,故引发期长,MDA值较低;而C样品由于敞口放置可与空气中的氧,微生物等氧化因素充分接触,引发期短,氧化迅速,但由于CSO渗漏量有限,放置初期MDA值升高不会太快。但之后,由于D样品存放温度较高,高温所导致的氧化加速,使体系产生的少量自由基引发体系进入快速氧化阶段,致使MDA值快速升高。而 C样品虽然引发期较短,但由于贮藏温度较低CSO渗漏量与D相比依然有限,外加羧甲基壳聚糖及脂质双分子层保护,致使体系中MDA值显著低于D样品。由于B、C条件下存放的CM-PL所处的温度与A相同,故渗漏率相差不大;但B、C样品都受到不同程度的氧化因素(光照、空气)的影响,故MDA值较A样品高。

图7　环境因素对CM-PL贮藏期间渗漏率的综合影响Fig.7　The combined effects of environment factors on the leakage ratio of CM-PL during storage

图8　环境因素对CM-PL贮藏期间MDA值的综合影响Fig.8　The combined effects of environment factors on the MDA value of CM-PL during storage

2.5氯化钠、葡萄糖对CM-PL稳定性的影响

粉末性产品在食用前多直接或复水后与其他物质混合存在,在该条件下的稳定性,将决定产品的存放状态及使用方便性。实验以4 g/L的食盐溶液与60 g/L的葡萄糖溶液作为食物共存成分的代表,以CM-PL在这两种溶液中复水后的外观色泽以及共存期间CSO的渗漏情况来衡量CM-PL的稳定性[15]。

结果发现与氯化钠共存样品在室温下放置两周内未出现分层、絮凝等现象。与葡萄糖共存样品,在放置6 d后就出现沉淀现象。从图9可看出,与氯化钠共存样品在1～6 d内CSO的渗漏较快,而6 d以后,渗漏率虽有所上升,但趋于平缓;而与葡萄糖共存样品的渗漏率在保存期间持续上升,2周后,与氯化钠共存及与葡萄糖共存样品的薏苡仁油的渗漏率分别为14.3%,21.1%,由于与葡萄糖共存样品的薏苡仁油渗漏量较高,引起脂质体间发生黏连,因此,样品易出现沉淀,分层现象。

图9　葡萄糖和氯化钠对贮藏期间CM-PL渗漏率的影响Fig.9　The effects of salt and glucose on the the leakage ratio of CM-PL during storage

3　小结

光照、空气接触、高温均能促进脂质氧化,导致不同程度的CSO渗漏,其影响顺序为温度>空气>光照。羧甲基壳聚糖对体系的光氧化和自氧化有一定的抑制作用。

CM-PL对氯化钠的耐受性好于葡萄糖,但稳定性较差,因此CM-PL适宜干燥状态存放,若需注射

给药时,应与注射液复水后立即使用。

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Study on the stability of carboxymethylchitosan-coated proliposomes loaded coix seed oil

BAI Chun-qing1,XIONG Hua2,CHEN Li-li1,YUAN Mei-lan1,JIANG Yong1,ZHAO Li1，*

(1.College of Life Science,Jiangxi Science and Technology Normal University,Nanchang 330013,China;2.Nanchang University,State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

The storage stability and water rehydtrate stabilty of carboxymethylchitosan-coated proliposomes(CM-PL)containing coix seed oil was studied. On one hand,coix seed oil(CSO)leakage rate and malondialdehyde(MDA)production during CM-PL stored under different conditions(light,oxygen,temperature)was determined for storage stability evaluation. On the other hand,the leakage rate of CSO after CM-PL rehydrated in sodium chloride solution or glucose solution was also measured for rehydtrated stabilty evaluation. The results indicated that the stability of CM-PL could be affected by light,higher temperature and air contact,and the influence was in the order of temperature>air>light. Higher temperature resulted in larger CSO leakage,which accelerated lipid oxidation further. The non significant difference among light treated or air contact groups with their control samples maybe related to the carboxymethylchitosan layer,which could delay the light-oxidation and auto-oxidation to some extent. However,the protection was limited,and CM-PL should be stored under vacuum,avoid light and low temperature condition. As to the other aspect,CM-PL exhibited better tolerance on sodium chloride than glucose,with the leakage ratio of 14.3% and 21.1%,respectively after 14 days’ storage.

carboxymethylchitosan;coix seed oil;proliposomes;stability

2015-08-04

白春清(1984-),女,博士,讲师,研究方向:薏苡仁油脂质体与微胶囊产品与特性研究,E-mail:chunqingbai01@aliyun.com。

赵利(1967-),女,博士,教授,研究方向：食品化学,E-mail:lizhao618@hotmail.com。

国家自然科学基金委员会资助项目(31560465);江西省科技厅青年科学基金资助项目(20151BAB214023)。

TS218

A

1002-0306(2016)05-0064-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.004