气相色谱结合主成分分析和聚类分析用于裸燕麦脂肪酸标准指纹图谱的建立

王超群,张　晖,钱海峰,王　立,齐希光

(江南大学食品学院,江苏无锡 214122)



气相色谱结合主成分分析和聚类分析用于裸燕麦脂肪酸标准指纹图谱的建立

王超群,张晖*,钱海峰,王立,齐希光

(江南大学食品学院,江苏无锡 214122)

采用气相色谱(GC)技术结合主成分分析(PCA)对62个不同产地及不同品种的燕麦样品脂肪酸进行分析鉴定。以PCA得分散点图区分出14个皮燕麦样品。对其余48个裸燕麦样品通过聚类分析优选46个样品,采用共有模式法筛选出它们含有的11种共有特征峰,并构建裸燕麦脂肪酸标准指纹图谱。通过方法学考察,11种共有脂肪酸精密度、重复性和稳定性的RSD分别小于3.069%、4.249%和4.900%,符合指纹图谱的检测要求。相似度分析得出46个样品的相似度均大于0.99,表明所建立的标准指纹图谱具有高度的特征性、唯一性和准确性。本研究弥补了裸燕麦指纹图谱信息的空白,进一步完善了谷物脂肪酸数据库,为谷物营养性脂质体鉴别技术体系构建奠定了基础。

气相色谱,主成分分析,聚类分析,燕麦,脂肪酸,指纹图谱

燕麦(AvenasativaL.)是世界第六大粮食作物,一般分为带稃型和裸粒型两种,即皮燕麦(A.sativaL.)和裸燕麦(A.nudaL.)[1]。在我国裸燕麦种植广泛,品种繁多,一般作食用,皮燕麦则主要用作牲口饲料[2]。燕麦被誉为药食同源的粮食作物,脂肪、蛋白质、维生素和矿物质含量居谷物之首,并且其中富含的膳食纤维和多种抗氧化活性类物质赋予了燕麦更多的医疗价值、保健作用和美容功效[3]。

市场上以裸燕麦为原料的产品层出不穷,包括燕麦面条、燕麦面包、燕麦饮料、燕麦膨化食品等[4]。在经济利益的驱使下,市场上的掺杂掺假及品质劣变现象不仅会影响消费者的身心健康和经济利益,也会对整个食品产业链产生很大的影响[5]。但是目前尚没有对燕麦及燕麦产品品质评价的质量标准,因此建立燕麦的品质鉴定和质量控制方法迫在眉睫。

指纹图谱技术是国际上公认的中药质量控制的最有效手段,现已被广泛应用于食品分析领域,并且所建立的食品中一些成分的指纹图谱对食品掺假和质量控制都具有重大的意义[6],但其在谷物特别是燕麦中的应用尚未可见。目前仅有翟旭光等[7]研究了燕麦麦谷蛋白SDS-PAGE电泳图谱作为燕麦指纹图谱,但分析方法复杂且结果仅可用来辅助鉴定燕麦属植物,应用范围较窄。研究报道骆姗等[8]建立了花生GC指纹图谱并应用于花生油的品质评价中;Tian H等[9]采用GC-MS构建小白杏仁脂肪酸指纹图谱并成功应用于小白杏仁油的鉴定与质量控制中;吴卫国等[10]也成功构建了5类食用植物油的标准指纹图谱以用于相应产品的质量控制和掺假检测。借鉴中药指纹图谱的研究理念及上述研究成果,结合燕麦中脂肪酸含量丰富[11],且气相色谱分析技术成熟简便的客观基础,本文采用气相色谱技术分析多个产地及品种燕麦中的脂肪酸,利用PCA分析判别皮燕麦和裸燕麦,通过聚类分析、共有模式法结合相似度分析构建裸燕麦脂肪酸标准指纹图谱,并对现有的燕麦品种资源进行脂肪酸的研究与分析,为进一步了解燕麦品种品质特性,筛选优良品种以及后期燕麦产品掺杂鉴定、品质监测及生产研究提供技术参考。

表1　所有燕麦原料信息

注:*为皮燕麦品种,其余为裸燕麦品种。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

燕麦原料来自2014年全国燕麦10个产地共62份样品,其中皮燕麦14种,裸燕麦48种，来源详见表1，其中各地名分别代表河北张家口农业科学院燕麦研究所、山西农科院品质所、甘肃省定西市旱农中心、青海畜牧兽医科学院草原研究所、新疆农科院作物所、云南昭通农科所、吉林白城农科院、宁夏固原农科所、内蒙古农科院园艺所、四川凉山州西昌农业研究所;正己烷国药集团化学试剂有限公司,色谱纯;无水乙醚、三氟化硼乙醚、氢氧化钠、无水甲醇、氯化钠、无水硫酸钠国药集团化学试剂有限公司,均为分析纯;Supelco37种脂肪酸甲酯混标(10 mg/mL),十九烷酸标准品(纯度≥99%)美国Sigma-Aldrich公司。

GC-2014气相色谱仪日本岛津公司;PEG-20M毛细管柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm)北京泰克美科技有限公司;FW100旋风式粉碎机天津泰斯特仪器有限公司;TM05C实验用碾米机日本佐竹机械有限公司;SOX406自动索式抽提仪济南海能仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1样品前处理裸燕麦籽粒经除杂后粉碎,过40目筛,标号,置于阴凉处密封保存;皮燕麦籽粒用脱壳机去壳后进行与上述相同的方法处理。

1.2.2纯油样品的提取采用索式抽提法,参照GB/T5512--2008。

1.2.3脂肪酸甲酯化处理[12]准确称取1.2.2中提取所得的油样20 mg,置于10 mL试管中,加入2 mL浓度为0.5 mol/L的NaOH-CH3OH溶液,于65 ℃水浴中加热皂化至油珠完全溶解(约30 min,其间取出振荡2～3次),静置冷却,加入25%的BF3-CH3OH溶液2 mL,同样在65 ℃水浴条件下酯化20 min,静置冷却,加入2.0 mL正己烷,充分振摇后加入2 mL饱和NaCl溶液,然后在3000 r/min的转速下离心15 min,取上层有机相于干燥样品瓶中,加入少量无水Na2SO4以除去微量的水,取上清液供气相色谱分析使用。

1.2.4气相色谱分析条件PEG-20M毛细管柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm);载气:高纯N2,吹扫流量:3 mL/min;进样量:1 μL;分流比100∶1;进样口温度250 ℃;升温程序:初始温度80 ℃,保持3 min,升温速率15 ℃/min升温至215 ℃,保持16 min,溶剂延迟时间1.5 min。

1.2.5脂肪酸测定采用Sigma 37种脂肪酸甲酯混标对样品中脂肪酸进行定性分析;以十九烷酸为内标对样品中脂肪酸进行定量分析[13]。

1.2.6数据分析采用SPSS19.0软件进行聚类分析和PCA分析。所有数据均进行三次平行实验。

表2　各主成分的特征值及方差贡献率

2结果与讨论

2.1主成分分析区分皮燕麦和裸燕麦品种

经气相色谱分析得到62个燕麦样品中所含脂肪酸共有26种,平均每种燕麦含有15种脂肪酸,其中棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳烯酸为6种平均含量高于1.00%且含量之和占总FFA含量97.35%的主要脂肪酸,这与王燕等[14]和戚向阳等[11]关于燕麦油脂中脂肪酸组成和含量的研究结果一致。

对62个样品中这6种脂肪酸进行PCA主成分分析。原始数据经标准化处理后,由相关矩阵出发,计算相关矩阵的特征值和特征向量,得到特征值和方差贡献率(见表2)。表2中每个主成分的方差特征值对应成分包含原有信息的多少。

通过具有Kaiser标准化的正交旋转后得到主成分载荷矩阵,即以每个载荷量来表示主成分与对应变量的相关关系,通过计算得到主成分表达式:

F1=0.061X1-0.218X2-0.843X3+0.944X4+0.803X5+0.107X6;

F2=-0.088X1-0.670X2-0.147X3+0.047X4+0.208X5+0.926X6;

F3=0.936X1+0.448X2-0.418X3-0.111X4-0.049X5+0.057X6。

从以上主成分表达式及表2可以看出,前3个主成分累计得分为82.659%(>80%),代表62种燕麦样品中脂肪酸含量82.659%的信息。其中,第一主成分F1的贡献率最高为38.482%,在变量油酸、亚油酸和亚麻酸具有较高的载荷系数,说明它们与F1有高的相关;同理,第二主成分F2的贡献率为23.033%,硬脂酸和二十碳烯酸与F2有高的相关;第三主成分F3的贡献率为21.143%,棕榈酸、硬脂酸和油酸与F3有高的相关。F1、F2和F3代表了燕麦脂肪酸的足够信息。

在SPSS19.0中根据62个燕麦样品中6种脂肪酸含量、表2中前两个主成分的特征值和6种脂肪酸的载荷值计算出62个燕麦样品的第一、第二主成分值。以第一主成分值为横坐标,第二主成分值为纵坐标作散点图[15]。散点图中每个点分别代表一个样品,点与点之间的距离代表各个样品之间的特征差异程度。由图1可知,62个燕麦样品根据距离远近及聚集程度基本可分为两个部分,图中区域内集中的散点代表裸燕麦样品,区域外散点(1、2、4、6、7、15、17、18、23、38、45、47、48、49、51)代表皮燕麦样品。

图1　62种裸燕麦样品的主成分散点图Fig.1　PCA biplot for sixty-two oat varieties

由表1可知,实际皮燕麦样品编号为1、2、3、4、5、6、7、15、17、18、45、47、48、49,因此PCA散点图中区分与实际基本相符,但皮燕麦样品中3和5未被区分开来,从图1中可以看出两者均在靠近区域外侧边缘部分,可能3和5的脂肪酸信息与裸燕麦样品较接近,因而未能分开;而区域外侧散点中23、38和51本是裸燕麦样品,同样也处在靠近区域边缘处,可能是这三个品种中的脂肪酸信息与其他裸燕麦稍有差异,因而未能聚集。由于种植燕麦的地区间气候条件和农业条件相差较大,加之基因及品种差异,各地种植的品种经长期栽培和适应,结果形成了各自的特征特性,在生态学和品质特性方面亦存在较大不同[16]。林伟静等[17]研究同样发现产地不同对燕麦样品中的脂肪酸含量也有相应的影响。因此产生上述现象的原因可能是所采集到的这5个样品的个体差异、基因及种植区域的影响。

2.248个裸燕麦品种脂肪酸聚类分析

由2.1可知,62个燕麦样品中裸燕麦因6种主要脂肪酸信息的高度相似性而在PCA散点图中聚集。根据这一相似性初步判断可以建立一种用以代表燕麦脂肪酸信息的标准指纹图谱。相对而言,裸燕麦在食品加工中的利用程度远远高于皮燕麦,因此本研究仅针对裸燕麦品种建立其标准指纹图谱。

由于产地、品种及不同批次样本的影响,不同样品中脂肪酸组成及含量存在一定的差异,这将会影响最终标准指纹图谱的构建效果。为了降低差异较大的样本的干扰,得到更为标准化的指纹图谱信息,对这48个裸燕麦样品进行了聚类分析[9]。采用组间联接法,以欧式距离(Euclidean distance)为度量标准,对原始变量采用Z得分法进行标准化的预处理,得到裸燕麦脂肪酸的聚类谱系图。谱系图中同一组内的数据对象具有较高的相似度,而不同组中的数据对象是不相同的。

图2　48个裸燕麦样品脂肪酸聚类谱系图Fig.2　Cluster pedigree diagram of fatty acid of 48 oat varieties注：纵坐标Case+数字代表表1中的产品编码。本图使用平均联接(组间)的树状图重新调整距离聚类合并。

由图2可知,case38和case51即38和51号样品与其他46个样品之间存在较大的差异,当取阈值为14.2时,样品阈值分割后可分为3类,即G1(38)、G2(51)、G3(其他)。这与2.1 PCA图中二者得分散点与其他裸燕麦样品距离较远的结果一致,但PCA图中区分出的23号样品在聚类分析图上与G3中其它样品有差异但未完全分开,这是由于23号样品的脂肪酸信息本就与裸燕麦信息相近,加之PCA和聚类分析方式及度量标准的不同而产生的。对于差异较大的样品38和51,若将它们引入指纹图谱的构建,可能会无形中将燕麦脂肪酸特征峰选取的盲目性随机放大,同时降低各谱图与共有模式的相似度,最终影响标准指纹图谱信息的准确性和可靠性[18]。因此选取G3中46个裸燕麦样品进一步实施指纹图谱分析。

2.3裸燕麦脂肪酸标准指纹图谱的建立

色谱指纹是通过对所有分析样本中大多数共有的化合物通过特定的信息化处理后建立的一种共有模式体系,该体系能够反映样品特有的品质,且对样品信息反馈存在唯一性和针对性,可用于样品真假的识别和产品质量优劣的判别[19]。对聚类分析优选的46个裸燕麦样品进行标准指纹图谱的构建。典型的裸燕麦脂肪酸指纹图谱见图3,图3中从上至下依次为:白燕2号(新疆)、白燕2号(吉林)、白燕2号(宁夏固原)、内燕5号(内蒙古)、青燕1号(青海)、定莜9号(山西)、9628-3(甘肃)、S20-171-9(河北)。

图3　裸燕麦脂肪酸气相色谱指纹图谱Fig.3　GC fingerprint of fatty acids of naked oats

本文以37种脂肪酸甲酯混标定性燕麦中的脂肪酸组成,并以十九烷酸为内标测定各脂肪酸含量。计算各峰所代表的脂肪酸的保留时间和相对含量(相对总脂肪酸含量的百分比)来对各脂肪酸进行分析。结果得出46个裸燕麦样品中所含脂肪酸共有26种,其中所有样本中同时存在的共有特征峰为11种。将这些共有脂肪酸信息取平均值,作为裸燕麦脂肪酸的标准特征信息(见表3),并构建其共有模式图,见图4。

图4　裸燕麦脂肪酸共有模式图Fig.4　The common pattern fingerprint of fatty acids of naked oats

2.4方法学考察

2.4.1精密度实验取同一燕麦样品,按1.2.3方法处理后,在1.2.4中的色谱条件下连续进样6次。结果得出,特征峰的保留时间RSD均小于0.892%,峰面积RSD均小于3.069%。表明气相色谱法分析精确度较高,符合指纹图谱的检测要求。

2.4.2重复性实验取同一燕麦样品6份,按1.2.3方法处理制成6份供试样品溶液后,在1.2.4中的色谱条件下进样分析。结果得出,特征峰的保留时间RSD均小于0.756%,峰面积RSD均小于4.249%。表明气相色谱法分析具有较好的重复性,符合指纹图谱的检测要求。

表4　不同产地品种裸燕麦脂肪酸信息及相似度分析

续表

注:0号为标准指纹图谱脂肪酸信息。

2.4.3稳定性实验取同一燕麦样品,按1.2.3方法处理后,密封于室温条件下保存,分别在供试样品制备完成后第0、4、8、12、16、20、24 h在1.2.4中的色谱条件进样分析。结果表明,特征峰的保留时间RSD均小于1.119%,峰面积RSD均小于4.900%。表明气相色谱法分析稳定性良好,符合指纹图谱的检测要求。

2.5裸燕麦样品的相似度分析

指纹图谱的相似度是指纹图谱的整体相关性,计算样品的相似度可以复核样品及建立样品的评定标准。常用的评价方法有欧氏距离、相关系数、向量夹角余弦等[20]。本实验以根据46个裸燕麦样品通过共有模式法建立的标准指纹图谱信息为对照,采用夹角余弦法计算出各图谱与标准指纹图谱的相似度。由表4可知,用以建立标准指纹图谱的46个燕麦样品与标准指纹图谱的相似度为0.9958～0.9999,均大于0.9958,而23、38和51号样品的相似度分别为0.9922、0.9952和0.9944,均小于0.9958,与其他样本有明显的差别,而且这与2.1PCA散点图和2.2聚类分析中的区分结果一致,说明利用主成分分析和聚类分析优选的样本构建的标准指纹图谱能够有效地反映样品的整体性,具有较高的准确度。

3　结论

本文采用气相色谱技术结合主成分分析和聚类分析构建裸燕麦脂肪酸标准指纹图谱,筛选出裸燕麦中11种共有特征脂肪酸信息,方法学考察及相似度评价表明所建立的标准指纹图谱能从化学成分的整体特征面代表裸燕麦的脂肪酸信息,精密度、重复性、稳定性良好,准确度较高。本文首次将指纹图谱理念应用于谷物中,但仅是针对燕麦复杂营养成分中的脂肪酸信息进行分析,并且基于各不同产地及品种的燕麦样品中脂肪酸信息的相似性而建立的脂肪酸标准指纹图谱,因此所建立的指纹图谱并不能用来鉴别燕麦产地及品种。但研究结果可为燕麦及燕麦产品品质评价及质量监控提供有力的理论依据,具有实际应用价值。

[1]赵秀芳,戎郁萍,赵来喜. 我国燕麦种质资源的收集和评价[J]. 草业科学,2007,24(3):36-40.

[2]白晓雷,刘艳春,生国利,等. 35份皮燕麦种质遗传多样性的SSR和SRAP分析[J]. 内蒙古农业科技,2015,43(4):6-11.

[3]章海燕,张晖,王立,等. 燕麦研究进展[J]. 粮食与油脂,2009(8):7-9.

[4]刘翠,巩阿娜,刘丽,等. 燕麦营养成分与加工制品现状研究进展[J]. 农产品加工(下),2015(4):67-70.

[5]Wang N,Zhang X,Yu Z,et al. Quantitative analysis of adulterations in oat flour by FT-NIR spectroscopy,incomplete unbalanced randomized block design,and partial least squares[J].Journal of Analytical Methods in Chemistry,2014,2014.

[6]姚云平,李昌模,刘慧琳,等. 指纹图谱技术在植物油鉴定和掺假中的应用[J]. 中国油脂,2012,37(7):51-54.

[7]翟旭光,潘志芬,商闯,等. 燕麦麦谷蛋白SDS-PAGE电泳分析[J].西南农业学报,2009,22(1):24-28.

[8]骆姗,张培,徐月敏,等. 基于气相色谱指纹图谱技术的花生油质量评价方法研究[J]. 食品工业科技,2014,35(8):58-60.

[9]Tian H,Zhan P,Zhang H. Development of a fatty acid

fingerprint of white apricot almond oil by gas chromatography and gas chromatography-mass spectrometry[J]. European Journal of Lipid Science and Technology,2014,116(2):126-133.

[10]吴卫国,彭思敏,唐芳,等.5类食用植物油标准指纹图谱的建立及其相似度分析[J].中国粮油学报,2013,28(6):101-105.

[11]戚向阳,曹少谦,刘合生,等. 不同品种燕麦的油脂组成及与其它营养物质相关性研究[J]. 中国食品学报,2014(5):63-71.

[12]刘国艳,王兴国,金青哲,等. 不同地区茶叶籽油理化指标及脂肪酸组成的比较分析[J]. 中国油脂,2013,38(7):85-88.

[13]Shin E C,Craft B D,Pegg R B,et al. Chemometric approach to fatty acid profiles in Runner-type peanut cultivars by principal component analysis(PCA)[J]. Food Chemistry,2010,119(3):1262-1270.

[14]王燕,钟葵,林伟静,等. 品种与环境效应对裸燕麦油脂含量和脂肪酸组成的影响[J]. 中国油脂,2012,37(7):27-32.

[15]Kim N S,Lee J H,Han K M,et al. Discrimination of commercial cheeses from fatty acid profiles and phytosterol contents obtained by GC and PCA[J]. Food Chemistry,2014,143:40-47.

[16]蒋妲.不同栽培条件的燕麦营养与品质的研究[D]. 北京:中国农业大学,2009.

[17]林伟静,吴广讽,李春红,等. 品种与环境对我国裸燕麦营养品质的影响[J]. 作物学报,2011,37(6):1087-1092.

[18]田洪磊. 新疆小白杏杏仁油生物活性物质指纹图谱及生物学功能研究[D]. 无锡:江南大学,2013.

[19]Tres A,van Ruth S M. Verification of organic feed identity by fatty acid fingerprinting[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(16):8816-8821.

[20]Zhu X,Gao Y,Chen Z,et al. Development of a Chromatographic Fingerprint of Tobacco Flavor by Use of GC and GC-MS[J]. Chromatographia,2009,69(7-8):735-742.

Establishment of fatty acids standard fingerprints of naked oats by GC combined with cluster analysis and principal component analysis

WANG Chao-qun,ZHANG Hui*,QIAN Hai-feng,WANG Li,QI Xi-guang

(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Fatty acids profile of 62 oat samples from different locations and species were analyzed through gas chromatography(GC)combined with principal component analysis(PCA). 14 leather oat varieties were distinguished through PCA scores scatterplot. Then 46 naked oat varieties were selected from the remaining 48 naked oat varieties by cluster analysis and 11 characteristic peaks in these naked oats were identified by total pattern method. Then characteristic and accuracy fatty acids standard fingerprint of naked oats was constructed and the similarities of the 46 samples were more than 0.99. Results of methodological study showed that RSD of precision,reproducibility and stability of the 11 kinds of fatty acids were good,respectively less than 3.069%,4.249% and 4.900%. It was in line with fingerprint testing requirements. This study filled the vacancy of naked oat fingerprint information,replenished grain fatty acid database,and laid the foundation of building a grain nutritional liposome identification technology system.

gas chromatography;principal component analysis;cluster analysis;oat;fatty acids;fingerprint

2015-09-14

王超群(1990-),女,硕士研究生,主要从事粮食深加工方面的研究，E-mail:125643657@qq.com。

张晖(1966-),女,博士,教授,主要从事粮食深加工方面的研究,E-mail:zhanghui@jiangnan.edu.cn。

国家“十二五”科技支撑计划(2012BAD37B08)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)10-0082-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.007