基底前脑巢蛋白阳性胆碱能神经元抗损伤作用

王缓缓，朱建华

（大理大学基础医学院，云南大理　671000）

基底前脑巢蛋白阳性胆碱能神经元抗损伤作用

王缓缓，朱建华*

（大理大学基础医学院，云南大理671000）

目的：探索基底前脑巢蛋白阳性和阴性胆碱能神经元对神经毒性损伤的不同反应。方法：30只SD大鼠随机分成5个组，即对照组和秋水仙碱Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组（10、20、50、100 μg）。分别经侧脑室注射10 μL生理盐水或不同剂量的秋水仙碱，24 h 后4%多聚甲醛灌注取脑，冰冻切片，行胆碱乙酰转移酶和巢蛋白免疫组化。计数和分析基底前脑不同区域巢蛋白阳性和阴性胆碱能神经元的数目。结果：侧脑室秋水仙碱注射后，大鼠基底前脑不同区域巢蛋白阳性和阴性胆碱能神经元数目都下降。注射剂量越大，神经元数目下降越明显。与巢蛋白阳性神经元相比，巢蛋白阴性胆碱能神经元下降出现更早，下降更明显。结论：巢蛋白表达可增强基底前脑胆碱能神经元的抗损伤作用。

基底前脑；巢蛋白；胆碱能神经元；神经可塑性

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.08.009

基底前脑主要含有胆碱能神经元、γ-氨基丁酸能神经元和谷氨酸能神经元。这些神经元发出纤维投射到海马和大脑皮质，与学习记忆密切相关。近年发现成年大鼠和成人的基底前脑都有一个连续的巢蛋白免疫反应阳性（nestin-immunoreactive，nestin-ir）的细胞带〔1-2〕。Nestin-ir细胞特异性地分布于基底前脑，能表达神经元特异性稀醇化酶（neuro-specific enolase，NSE）和神经元特异性核蛋白（neuron-specific nuclear protein，NeuN），但不表达胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP），而且其形态及大小均与成熟的神经元相似〔2〕。用膜片钳技术与单细胞RT-PCR技术，免疫荧光三标与激光共聚焦扫描术证实基底前脑的巢蛋白阳性神经元是一类成熟的神经元，属于胆碱能神经元的一种亚型〔3-4〕。与巢蛋白阴性胆碱能神经元相比，巢蛋白阳性的胆碱能神经元具有较大的超极化激活的内向电流（Ih）和较大的兴奋性突触后电流〔3〕。因此，巢蛋白阳性和巢蛋白阴性胆碱能神经元在学习记忆及其他生理活动中可能具有功能差异性。本研究通过不同剂量的秋水仙碱侧脑室注射，观察秋水仙碱对巢蛋白阳性和巢蛋白阴性胆碱能神经元的数目影响，以探索两种神经元的神经可塑性差异。

1　材料和方法

1.1实验动物SD大鼠30只，体重（250±20）g，由昆明医科大学实验动物中心提供，生产许可证编号：SYXK（滇）2005-0004。实验过程中所有动物均饲养于相同环境，自然明暗周期，自由进食进水，常规饲料喂养。采用随机数字表法将动物分为5个组，即：正常对照组、秋水仙碱Ⅰ组（10 μg）、秋水仙碱Ⅱ组（20 μg）、秋水仙碱Ⅲ组（50 μg）、秋水仙碱Ⅳ组（100 μg），每组大鼠6只。

1.2实验试剂秋水仙碱（华美生物公司，sigma），用灭菌生理盐水配制成1%的浓度；兔抗胆碱乙酰转移酶（anti-choline acetyltransferase，ChAT）多克隆抗体，工作浓度：1：1 000；小鼠抗巢蛋白（anti-nestin）单克隆抗体，工作浓度：1：2 000。两种抗体均购于Merck Millipore公司。常规免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司，其他试剂为国产分析纯。

1.3侧脑室注射各组大鼠均使用1%戊巴比妥钠腹膜腔注射麻醉，固定于脑立体定位仪上，按PAXINOS和WATSON〔5〕编著的大鼠脑立体定位图谱，以前囟点为参照，在前囟后0.4 mm、左侧1.5 mm 和4.6 mm深度用微量进样器向左侧侧脑室分别注入10 μL灭菌生理盐水，或10、20、50、100 μg的秋水仙碱。

1.4取脑与切片各组大鼠在侧脑室注射术后24 h经心脏进行4%多聚甲醛常规灌注固定，取脑，脑组织用4%多聚甲醛后固定4 h，然后依次置于15%及30%蔗糖磷酸缓冲液中4℃保存脱水，直至沉底。冰冻切片，片厚30 μm，每隔5张切片取一片。

1.5免疫组化使用免疫组化ABC法进行ChAT及巢蛋白测定。切片先入0.3%H2O2，室温30 min；1% BSA（含0.3%Triton X-100）37℃30 min；一抗37℃孵育2 h后置4℃冰箱过夜；二抗、三抗分别在37℃温箱孵育2 h；0.05%DAB（含0.01%H2O2）室温显色时间3 min。以上除1%BSA封闭后直接入一抗外，其余各步骤之间均用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）漂洗5 min，3次。贴片后晾干，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.6细胞计数及统计分析按照文献方法，计数注射侧基底前脑内侧隔核（medial septum，MS）、斜角带核水平垂直支（vertical diagonal band，vDB）和水平支（horizontal diagonal band，hDB）的ChAT及巢蛋白阳性神经元。因为以往的研究已证实巢蛋白阳性神经元是胆碱能神经元的一个亚群，而免疫组化双标染色影响因素较多，故本实验以相邻脑片分别进行ChAT和巢蛋白免疫组化测定，以ChAT阳性神经元的数目减去巢蛋白阳性神经元的数目作为巢蛋白阴性胆碱能神经元数目。用SPSS13.2专业统计软件，单因素方差分析（ANOVA）分析各组大鼠MS、vDB和hDB两种神经元的数目总体差异，使用LSD检验进行各均数间比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

基底前脑ChAT及巢蛋白阳性神经元分布区域一致，分布于MS、vDB及hDB，形成一个从MS到 vDB的倒“V”字形的条带。在MS处的巢蛋白阳性神经元较小，常呈梭形，垂直排列；在vDB及hDB处的巢蛋白阳性神经元较大，常为多角形。

对照组大鼠基底前脑巢蛋白阳性和巢蛋白阴性胆碱能神经元数目之间差异无统计学意义。侧脑室秋水仙碱注射后，大鼠基底前脑MS、vDB及hDB 3个区域巢蛋白阳性和巢蛋白阴性胆碱能神经元的数目都发生下降。随着秋水仙碱注射剂量增大，两种神经元的数目下降更加明显，当秋水仙碱侧脑室注射量达到20 μg时hDB的巢蛋白阴性胆碱能神经元与巢蛋白阳性胆碱能神经元之间开始出现显著性差异；当注射量达到100 μg时，MS、vDB和hDB的巢蛋白阴性胆碱能神经元与巢蛋白阳性胆碱能神经元之间差异均有统计学意义。见表1。

表1　不同剂量的秋水仙碱注射后巢蛋白阳性和巢蛋白阴性胆碱能神经元的数目

秋水仙碱的注射量为10 μg时，基底前脑MS和vDB的巢蛋白阴性胆碱能神经元数目与对照组之间差异具有统计学意义。见图1。但侧脑室注射秋水仙碱的量达到20 μg以后，基底前脑hDB、MS和vDB的巢蛋白阳性胆碱能神经元的数目与对照组之间才依次出现统计学差异。见图2。

图1　秋水侧碱侧脑室注射后基底前脑巢蛋白阴性胆碱能神经元数目的变化

图2　秋水侧碱侧脑室注射后基底前脑巢蛋白阳性胆碱能神经元的变化

3　讨论

巢蛋白是一种Ⅵ型中间丝蛋白，主要在神经前体细胞一过性表达，当神经前体细胞转化为神经元之后由其他的中间丝蛋白取代，因此，巢蛋白常作为特异性的标记物，广泛用于活体和体外培养的神经前体细胞鉴定〔7-8〕。在正常成年脑组织中，巢蛋白主要在具有神经发生功能的部位（如室管膜下区和海马齿状回），血管内皮细胞〔9-11〕以及激活的神经胶质细胞中表达〔12〕。然而，最近发现成年大鼠基底前脑和成人的基底前脑都有一个连续的nestin-ir神经元构成的细胞带〔1-2〕。研究表明，受试大鼠基底前脑的nestin-ir神经元数量与大鼠的平均逃避潜伏期呈显著的负相关关系〔13〕。以上结果提示老年性记忆减退的神经机制与基底前脑的nestin-ir神经元退变关系密切。通过免疫荧光三标与激光共聚焦扫描术、单细胞RT-PCR及电生理的研究表明基底前脑的巢蛋白阳性神经元是一类成熟的神经元，属于胆碱能神经元，数目约占胆碱能神经元的50%〔3〕。因此，基底前脑胆碱能神经元可根据是否表达巢蛋白分为两个亚群，即巢蛋白阳性的胆碱能神经元与巢蛋白阴性的胆碱能神经元〔3-4〕。

秋水仙碱是一种有丝分裂毒素，以往研究表明侧脑室注射秋水仙碱能导致基底前脑的胆碱能神经元不可逆性减少〔14〕。早期的研究表明大鼠侧脑室注射秋水仙碱后，巢蛋白阳性神经元一过性降低后可以恢复，提示表达巢蛋白的神经元有较好的可塑性〔15〕。切断嗅神经后，经基底前脑巢蛋白阳性和阴性的胆碱能神经元数都会减少，但巢蛋白阳性神经元数目减少迟于巢蛋白阴性的胆碱能神经元，提示巢蛋白阳性神经元对机械损伤有更强的耐受性〔16〕。

最初发现基底前脑的巢蛋白阳性神经元时，巢蛋白阳性神经元被认为是基底前脑胆碱能神经元和γ-氨基丁酸能神经元之外的一类独立的神经元。周立兵等曾进行过秋水仙碱毁损巢蛋白阳性神经元的试验，侧脑室秋水仙碱注射后24 h基底前脑巢蛋白阳性神经元数目降到最低〔15〕。但后来的研究进一步揭示巢蛋白阳性神经元是胆碱能神经元的一个亚群，胆碱能神经元可分为巢蛋白阳性和巢蛋白阴性胆碱能神经元。因此，与以往的实验不同，本实验主要是比较巢蛋白阳性和巢蛋白阴性胆碱能神经元对不同剂量的秋水仙碱毒性损伤反应的差异。

本实验在侧脑室内注射不同剂量的秋水仙碱，发现随着注射剂量的增加，基底前脑巢蛋白阳性和巢蛋白阴性胆碱能神经元的数目都减少。其中巢蛋白阴性的胆碱能神经元数目减少出现得更早，减少得更明显。提示巢蛋白阳性的胆碱能神经元对秋水仙碱引起的神经元损伤有更强的耐受性。另外，侧脑室秋水仙碱注射导致的基底前脑神经元减少是有区域差异性的，MS和vDB的神经元较早受到影响，而hDB神经最后才出现损害。这可能跟基底前脑不同区域与侧脑室的距离不同有关。

结合前期研究的发现巢蛋白阳性的胆碱能神经元并不是新生的神经元〔17〕，可以认为巢蛋白表达使胆碱能神经元维持一种特殊的功能状态。这种状态赋予神经元特定的功能（如较大的兴奋性）和较大的生存能力，因此，当受到有害因子的刺激时不容易出现损伤和死亡。巢蛋白对神经元功能的影响及其意义仍需进一步研究。

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〔Abstract〕Objective:To explore the different responses of basal forebrain nestin positive and negative cholinergic neurons to the neurotoxicity.Methods:30 SD rats were randomly divided into 5 groups，which are control group and colchicineⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳgroups （10，20，50，100 μg）.10 microliters of normal saline or different doses of colchicine were injectedintracerebroventricularly.24 hours after injection，4%paraformaldehyde intracardiac perfusion，brain removal，frozen section，choline acetyltransferase and nestin immunohistochemistry were carried out.Then，the nestin positive and negative cholinergic neurons of different basal forebrain regions were counted and analyzed.Results:After intracerebroventricular injection of colchicine，the nestin positive and negative cholinergic neurons in different regions of rats'basal forebrain decreased.The greater the colchicine injection dose is，the more obvious the decrease of the neurons.Compared with nestin positive neurons，the nestin negative cholinergic neurons decreased earlier and more significantly.Conclusion:the nestin expression can enhance the damage resistant ability of basal forebrain cholinergic neurons.

〔Key words〕basal forebrain；nestin；cholinergic neurons；neural plasticity

（责任编辑李杨）

Damage Resistance of Basal Forebrain Nestin-positive Cholinergic Neurons

Wang Huanhuan，Zhu Jianhua*
（Pre-clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

R322.81

A

2096-2266（2016）08-0035-04

国家自然科学基金资助项目（31160221）

2016-02-26

王缓缓，硕士研究生，主要从事神经生物学研究.

朱建华，教授，博士.