乳矿物盐复合粉免疫调节作用的研究

黄远英，杨亚飞（汤臣倍健股份有限公司，广东广州510663）

乳矿物盐复合粉免疫调节作用的研究

黄远英，杨亚飞
（汤臣倍健股份有限公司，广东广州510663）

研究乳矿物盐复合粉对小鼠免疫功能的调节作用。分别以0.375、0.75、2.25 g/kg·bw剂量的乳矿物盐复合粉对小鼠连续灌胃30 d后，测定各项免疫指标。乳矿物盐复合粉能促进小鼠淋巴细胞增殖转化作用，提高小鼠的抗体生成细胞及血清溶血素水平，促进小鼠的单核-巨噬细胞的吞噬功能。乳矿物盐复合粉具有增强免疫力功能作用。

乳矿物盐；低聚半乳糖；乳铁蛋白；免疫力

乳矿物盐又名乳钙、乳清矿物质浓缩物、乳清钙，以乳清为原料，其主要成分是磷酸钙，除此之外还包括蛋白质、乳糖及锌、磷、钠、钾、镁等丰富的营养成分，含钙量约为23%～28%，其钙磷比为2∶1（质量比），较利于人体吸收利用，作为一种新钙源被广泛用于各种食品［1］。

低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS），是一种具有天然属性的功能性低聚糖。动物乳汁中存在微量GOS，而人母乳中含量较多，是母乳中重要的益生元，其安全性已受到广泛认可。低聚半乳糖是唯一都能够被人体肠内8大有益菌所利用的，其还能有效地促进肠道对钙的吸收［2］。

乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是一种多功能的蛋白质，含有人体所需的多种成分。可作为人体营养来源，补充铁和氨基酸，又可作为预防和治疗人类多种疾病的药物，用于维持肠道内菌群平衡，防止感染和抵抗病毒，抑制肿瘤发生与转移，阻碍体内产生自由基损伤机体等［3］。

本研究将乳矿物盐、低聚半乳糖和乳铁蛋白按一定比例进行复配，制得乳矿物盐复合粉，对小鼠进行增强免疫力功能实验，为开发增强免疫力的功能食品提供了理论参考。

1　材料与方法

1.1实验动物

健康SPF级昆明种小鼠：山东大学动物实验中心提供，生产许可证：SCXK（鲁）20130009。

1.2样品

乳矿物盐复合粉（MCCP）：内容物为淡黄色粉状，由汤臣倍健股份有限公司提供，推荐日服用建议剂量为4.5 g/袋。

1.3剂量选择和受试物给予方式

实验小鼠按随机分组原则分为低剂量组（MCCPL，0.375 g/kg·bw）、中剂量组（MCCP-M，0.75 g/kg·bw）、高剂量组（MCCP-H，2.25 g/kg·bw）（分别相当于日服用建议剂量的5、10、30倍）及对照组（Control组）。每天1次，灌胃体积按20 mL/kg·bw，连续灌胃30 d。对照组以等体积的蒸馏水灌胃。

1.4主要仪器与试剂

1.4.1主要仪器

BL3100电子天平：德国赛多利斯公司；3-18K高速冷冻离心机：德国SIGMA公司；722型可见-紫外分光光度计：上海现科分光公司；ELX800酶标仪：美国BIO-TEK公司；DYX-DHS-40X50隔水式电热恒温培养箱：上海市跃进医疗器械一厂；HWS-28恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司；10 μL～100 μL微量加样器：德国BRAND公司；DP71-IPP6.0光学显微镜：日本奥林巴斯株式会社；RE-5003旋转蒸发仪：上海光学仪器厂。

1.4.2主要试剂

绵羊红细胞（SRBC）、鸡红细胞（CRBC）、氧化型辅酶I，ConA、补体、Hank’s液青链霉素、MTT、小牛血清、PBS缓冲液、琼脂糖：以上试剂均购自sigma公司；印度墨汁：购自上海信裕生物科技有限公司；1%冰醋酸：购自国药集团化学试剂有限公司。

1.5方法

1.5.1脏器体重比值测定

小鼠称重后处死，取出胸腺、脾脏，去尽筋膜及表面血污，称重，计算胸腺体重比值及脾脏体重比值。1.5.2迟发型变态反应

采用足趾增厚法。免疫后4天，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射SRBC，注射后于24 h测量左后足跖部厚度，同一部位测量3次，取平均值。1.5.3ConA诱导的小鼠淋巴转化实验

取脾脏，制成细胞悬液，采用MTT法，波长570nm，酶标仪测定光密度。

1.5.4小鼠血清溶血素测定

分离血清，按血凝法观察血细胞凝集程度，计算抗体积数。

1.5.5抗体生成细胞检测

用脱纤维绵羊红细胞免疫，取脾脏，制成脾细胞悬液，按Jerne改良玻片法，计数溶血空斑数。

1.5.6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

采用半体内法。制备鸡红细胞悬液，每只鼠腹腔注射，间隔30 min，腹腔注入生理盐水2 mL，吸出腹腔洗液1 mL，移置37℃温箱孵育30 min，然后，于生理盐水中漂洗，晾干，以体积比1∶1丙酮—甲醇溶液固定，体积分数4%Giemsa-磷酸缓冲液染色3 min，再用蒸馏水漂洗晾干，光镜下观察。1.5.7小鼠碳廓清实验

经尾静脉注入稀释的印度墨汁，并立即计时。注入墨汁后2 min及10 min分别从眼内眦静脉丛取血20 μL，并将其加到2 mL处0.1%Na2CO3溶液中，用722分光光度计600 nm波长处测光密度值。

1.5.8NK细胞活性测定

取脾脏，制成细胞悬液，按乳酸脱氢酶（LDH）法，用酶标仪在490 nm处测定光密度值。

1.6实验数据统计

实验数据用SPSS软件对各实验原始数据进行方差齐性检验，满足“方差齐”要求的数据资料用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理；对方差不齐的数据资料进行适当的变量转换，待满足“方差齐”要求后，用转换所得的数据进行统计处理。

2　结果

2.1乳矿物盐复合粉对小鼠脏器体重比值的影响

2.1.1脾脏/体重比值

小鼠脏器体重比值试验中，与对照组相比，高、中、低各剂量组小鼠的脾脏/体重比值和胸腺/体重比值均无显著性差异，结果无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。经方差分析，P=0.783，各剂量组分别与水对照组小鼠相比，其脾脏/体重比值均无显著性差异（P＞0.05），见表1。

表1　乳矿物盐复合粉脏器/体重比值的影响Table 1　Effects of milk calcium compound powder on mice immune organ/body weigh ratio（±s，n=10）

表1　乳矿物盐复合粉脏器/体重比值的影响Table 1　Effects of milk calcium compound powder on mice immune organ/body weigh ratio（±s，n=10）

注：-表示灌胃等体积蒸馏水。

组别　剂量/ （g/kg·bw）脾脏/体重比值/ （mg/g）胸腺/体重比值/ （mg/g）对照组　-　5.119±0.619　 4.208±0.727 MCCP-L　0.375　4.989±0.883　4.685±0.884 MCCP-M　0.75　5.294±0.892　4.677±0.613 MCCP-H　2.25　5.327±0.909　4.893±1.083

2.1.2胸腺/体重比值

经方差分析，P=0.333，各剂量组分别与水对照组小鼠相比，其胸腺/体重比值均无显著性差异（P＞0.05），见表1。

2.2乳矿物盐复合粉对小鼠迟发型变态反应（DTH）的影响

经方差分析，P=0.820，各剂量组分别与水对照组小鼠相比，其足跖肿胀度差异无显著性（P＞0.05），结果见表2。

2.3ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验（MTT法）

经方差分析，P=0.006。低剂量组与水对照组小鼠相比，其淋巴细胞增殖能力无显著性差异（P＞0.05）；中、高剂量组与水对照组小鼠相比，其淋巴细胞增殖能力有显著性差异（P＜0.05）。结果见表3。

表3　乳矿物盐复合粉对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力的影响Table 3　Effects of milk calcium compound powder on lymphocyte transformation test induced by ConA in mice（±s，n=10）

表3　乳矿物盐复合粉对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力的影响Table 3　Effects of milk calcium compound powder on lymphocyte transformation test induced by ConA in mice（±s，n=10）

注：-表示灌胃等体积蒸馏水；与对照组比较，*P＜0.05。

组别　剂量/（g/kg·bw）　淋巴细胞增值能力/mm对照组　-　0.235±0.033 MCCP-L　0.375　0.258±0.033 MCCP-M　0.75　0.278±0.032* MCCP-H　2.25　0.298±0.052*

表2　乳矿物盐复合粉对小鼠迟发型变态反应（DTH）的影响Table 2　Effects of milk calcium compound powder on DTH against SRBC（±s，n=10）

表2　乳矿物盐复合粉对小鼠迟发型变态反应（DTH）的影响Table 2　Effects of milk calcium compound powder on DTH against SRBC（±s，n=10）

注：-表示灌胃等体积蒸馏水。

组别　剂量/（g/kg·bw）　足跖肿胀度/mm对照组　-　0.605±0.219 MCCP-L　0.375g　0.614±0.328 MCCP-M　0.75　0.654±0.301 MCCP-H　2.25　0.708±0.203

2.4乳矿物盐复合粉对小鼠血清溶血素产生的影响

经方差分析，P=0.002。低剂量组与水对照组小鼠相比，其小鼠血清抗体积数无显著性差异（P＞0.05）；中、高剂量组与水对照组小鼠相比，其小鼠血清抗体积数有显著性差异（P＜0.05）。结果见表4。

表4　乳矿物盐复合粉对小鼠血清溶血素产生的影响Table 4　Effects of milk calcium compound powder on serum HC50（±s，n=10）

表4　乳矿物盐复合粉对小鼠血清溶血素产生的影响Table 4　Effects of milk calcium compound powder on serum HC50（±s，n=10）

注：-表示灌胃等体积蒸馏水；与对照组比较，*P＜0.05。

组别　剂量/（g/kg·bw）　抗体积数对照组　-　171.8±21.1 MCCP-L　0.375　176.8±17.0 MCCP-M　0.75　198.2±17.1* MCCP-H　2.25　201.6±22.1*

2.5抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）

经方差分析，P=0.002。低剂量组与水对照组小鼠相比，其小鼠抗体生成细胞数无显著性差异（P＞0.05）；中、高剂量组与水对照组小鼠相比，其小鼠抗体生成细胞数有显著性差异（P＜0.05）。结果见表5。

表5　乳矿物盐复合粉对小鼠抗体生成细胞数的影响Table 5　Effects of milk calcium compound powder on the ability of antibody（±s，n=10）

表5　乳矿物盐复合粉对小鼠抗体生成细胞数的影响Table 5　Effects of milk calcium compound powder on the ability of antibody（±s，n=10）

注：-表示灌胃等体积蒸馏水；与对照组比较，*P＜0.05。

组别　剂量/（g/kg·bw）　PFC/（×103/WSC）对照组　-　40.80±25.00 MCCP-L　0.375　51.52±23.67 MCCP-M　0.75　74.25±24.81* MCCP-H　2.25　88.65±36.26*

2.6乳矿物盐复合粉对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响

各剂量组与水对照组小鼠相比，其腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率及吞噬指数均无显著性差异（P＞0.05），结果见表6。

表6　乳矿物盐复合粉对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响Table 6　Effects of milk calcium compound powder on macrophage phagocytosis in rats（±s，n=10）

表6　乳矿物盐复合粉对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响Table 6　Effects of milk calcium compound powder on macrophage phagocytosis in rats（±s，n=10）

注：-表示灌胃等体积蒸馏水。

组别　剂量/（g/kg·bw）　吞噬率/%　吞噬指数对照组　-　25.8±11.2　0.37±0.12 MCCP-L　0.375　31.0±13.2　0.45±0.15 MCCP-M　0.75　34.5±14.8　0.47±0.17 MCCP-H　2.25　37.7±16.4　0.51±0.18

2.7小鼠碳廓清实验

经方差分析，P=0.008。低剂量组与水对照组小鼠相比，其对小鼠单核-巨噬细胞吞噬指数无显著性差异（P＞0.05）；中、高剂量组与水对照组小鼠相比，其对小鼠单核-巨噬细胞吞噬指数有显著性差异（P＜0.05），结果见表7。2.8乳矿物盐复合粉对小鼠NK细胞活性的影响

表7　乳矿物盐复合粉对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清能力的影响Table 7　Effects of milk calcium compound powder on carbon clearance index（K）（±s，n=10）

表7　乳矿物盐复合粉对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清能力的影响Table 7　Effects of milk calcium compound powder on carbon clearance index（K）（±s，n=10）

注：-表示灌胃等体积蒸馏水；与对照组比较，*P＜0.05。

组别　剂量/（g/kg·bw）　吞噬指数对照组　-　4.563±0.584 MCCP-L　0.375　5.035±0.531 MCCP-M　0.75　5.350±0.762* MCCP-H　2.25　5.562±0.659*

经方差分析，P=0.174。各剂量组与水对照组小鼠相比，其NK细胞活性率均无显著性差异（P＞0.05）。结果见表8。

表8　 乳矿物盐复合粉对小鼠NK细胞活性的影响Table 8　Effects of milk calcium compound powder on NK cell activity（±s，n=10）

表8　 乳矿物盐复合粉对小鼠NK细胞活性的影响Table 8　Effects of milk calcium compound powder on NK cell activity（±s，n=10）

注：-表示灌胃等体积蒸馏水。

组别　剂量/（g/kg·bw）　NK细胞活性率/%对照组　-　17.27±4.34 MCCP-L　0.375　12.72±2.95 MCCP-M　0.75　14.20±5.75 MCCP-H　2.25　14.68±5.46

3　小结

分别经口给予小鼠0.375、0.75、2.25 g/kg·bw剂量的乳矿物盐复合粉30 d，对小鼠体重增长无不良影响，对小鼠脾脏体重比值和胸腺体重比值无影响，小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能、小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能各中高剂量组指标与对照组比较均有显著差异（P﹤0.05），且有统计学意义，结果均为阳性。小鼠NK细胞活性测定结果为阴性。按照《保健食品检验与评价技术规范》对增强免疫力功能保健食品的判定标准可知，乳矿物盐复合粉具有增强小鼠免疫功能的作用。

［1］邵胜荣，孙俊.乳矿物盐的研究动态及应用进展［J］.添加剂与营养，2013，1（2）：58-59

［2］薛雅莺，袁卫涛，杨海军，等.低聚半乳糖的特性及应用前景［J］.发酵科技通讯，2011，40（3）：50-52

［3］李林，刘思国，成国祥.乳铁蛋白的结构与功能［J］.食品与药品，2006，8（12A）：28-31

Study on the Immunoregulatory Function of Milk Calcium Compound Powder

HUANG Yuan-ying，YANG Ya-fei （BY-HEALTH CO.LTD.，Guangzhou 510663，Guangdong，China）

To study the immunoregulation effect of milk calcium compound powder in mice.After administration of milk calcium compound powder for 30 days conscutively with the dose of 0.375，0.75，2.25 g/kg·bw，immunological indexes were measured.Proliferation and transformation of spleen lymphocytes in the mice was increased.The number of antibody-producing cells and the level of serum hemolysin was enhanced.Phagocytic function of monocyte-macrophage was promoted.Milk calcium compound powder can strengthen the immunofunction in mice.

milkcalcium；galactooligosaccharides；lactoferrin；immunofunction

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.047

黄远英（1982—），女（汉），公共营养师，本科，研究方向：功能食品与药物制剂。

2015-08-14