桑黄不同组分抗氧化活性的比较分析

杨丽维，杨红澎，确生，班立桐，*（.天津市林业果树研究所，天津0084；.天津农学院，天津0084；.青海师范大学民族师范学院化学系，青海西宁80008）

桑黄不同组分抗氧化活性的比较分析

杨丽维1，杨红澎2，确生3，班立桐2，*
（1.天津市林业果树研究所，天津300384；2.天津农学院，天津300384；3.青海师范大学民族师范学院化学系，青海西宁810008）

采用铁离子还原/抗氧化力测定法（ferric reducing/antioxidant power assay，FRAP）、邻苯三酚法、水杨酸法，比较研究桑黄不同极性组分的抗氧化活性。结果显示，4种桑黄不同组分体外总抗氧化能力高低顺序依次是：水溶性组分＞乙酸乙酯组分＞乙醇组分。在清除羟自由基（·OH）试验中发现石油醚组分对羟自由基清除能力最强，远远高于水溶性成分，乙酸乙酯组分和乙醇组分也很强。在清除超氧阴离子（O2-·）试验中发现乙醇组分活性最高，石油醚组分次之。

桑黄；抗氧化；比较分析

桑黄属于担子菌亚门（Basidiomycotina）、层菌纲（Hymenomycetes）、多孔菌目（polyporales）、多层孔菌科（Hymenoehaetacae）、针层孔菌属（Phellinus），是一种多年生的珍稀药用真菌［1-2］。桑黄主要含有多糖，其次还有黄酮、三萜和落叶松覃酸等化合物，具有抗癌、增强免疫力、抗肝纤维化、抗脂质过氧化、抗肺炎等功效［3］。由于其生理复杂性、特殊性以及对外部生长环境的较高要求，其在自然界中形成子实体比较困难，尤其是需要多年才能形成可药用的子实体。加之，近几年人们对野生桑黄的大量采集，天然的桑黄资源已经非常稀少。目前大多数研究集中在研究桑黄水溶性多糖的活性和结构研究上［4-6］。对其不同极性组分的活性研究还鲜见文献报道。通过体外抗氧化试验研究桑黄不同极性化合物的活性对进一步研究桑黄有一定的意义。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1原料

桑黄于西藏拉萨购买。

1.1.2主要试剂

三吡啶三吖嗪（tripyridyl-triazine、TPTZ）：Sigma；FeCl3、FeSO4、无水乙酸钠、乙酸、邻苯三酚、水杨酸、过氧化氢：均为国产分析纯。

1.1.3主要仪器

UV-8500紫外可见分光光度计：日本岛津；AEZ00电子天平：瑞士METTLER公司；HH-W21-600水浴箱：中国东方公司；LGJ-18S冷冻干燥机：北京松源华兴。

1.2方法

1.2.1不同极性组分的获得

将桑黄粉碎，称取300 g分别用石油醚、乙酸乙酯、乙醇、水依次分别提取3次，并分别合并3次提取液浓缩冷冻干燥备用。

1.2.2抗氧化活性的测定

1.2.2.1总抗氧化能力的测定

采用FRAP法［7-8］。操作步骤：①标准曲线的测定：取10 μL不同浓度FeSO4溶液，加入1.8 mL的FRAP工作液（pH3.6的醋酸钠溶液、10 mmol/L的TPTZ甲醇溶液和20 mmol/L的FeCl3溶液按10∶1∶1比例配制），37℃水浴10 min，以醋酸钠调零，在593 nm下测吸光度，绘制标准曲线。②分别取10 μL浓度为10 mg/mL上述4种不同极性组分样品，处理方法同上，测定吸光度。③根据FeSO4标准曲线，以1.0 mmol/LFeSO4为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO4的毫摩尔数表示。每份样品重复测定5次。

1.2.2.2清除超氧阴离子（O2-·）能力的测定

采用邻苯三酚法［9］。操作步骤：①分别取10 μL浓度为10 mg/mL上述4种不同极性组分样品，加入3 mL pH为8.2的tris-HCl缓冲液，25℃水浴20 min。②水浴结束时，各样品中加入7 mmol/L的邻苯三酚溶液，反应4 min后加入28 μL 10 mol/L的盐酸终止反应，以tris-HCl缓冲液调零在420 nm处测吸光度值，根据抑制率判断样品对清除的能力。每份样品重复测定5次。

抑制率/%=［A对照-（A样品-A样品空白）］/A对照×100

式中：A对照为不加样品的反应体系；A样品为加入样品的反应体系；A样品空白为不加邻苯三酚的反应体系。1.2.2.3清除羟自由基（·OH）能力的测定（水杨酸法）

采用水杨酸法［10］。操作步骤：①分别取10 μL浓度为10 mg/mL上述4种不同极性组分，分别加入8.8 mmol/L H2O21 mL，10 mmol/L FeSO41 mL，10 mmol/L水杨酸1 mL。②加H2O2启动反应，37℃反应0.5 h。③以蒸馏水作参比，在510 nm下测吸光度。每份样品重复测定5次。

式中：A0为对照液的吸光度；A1为加入样品后的吸光度；A2为不加显色剂H2O2样品溶液的吸光度。

2　结果

2.1桑黄总抗氧化能力测定结果

取10 μL浓度为0.05、0.5、1、1.5、2、2.5 mol/L FeSO4溶液，加入1.8 mL的FRAP工作液，37℃水浴10 min，以醋酸钠调零，在593 nm下测得各浓度吸光度，以吸光度为纵坐标对应各浓度FeSO4作横坐标绘制标准曲线见图1。

图1　FeSO4标准曲线Fig.1　The standard curve for FeSO4

检测结果表明，593 nm处FeSO4浓度与吸光度在一定范围内呈线性关系，线性回归方程为y=0.089 1x+ 0.559 4，R2=0.992 2。

依据标准曲线，测得4种桑黄不同组分体外总抗氧化能力结果见表1。

表1　桑黄不同组分总抗氧化能力测定结果（±s，n=5）Table 1　The total antioxidant capacity from Phellinus igniarius （±s，n=5）

表1　桑黄不同组分总抗氧化能力测定结果（±s，n=5）Table 1　The total antioxidant capacity from Phellinus igniarius （±s，n=5）

桑黄不同组分　总抗氧化能力石油醚组分乙酸乙酯组分乙醇组分水溶性组分0 23.5±0.18 22.9±0.21 25.8±0.13

总抗氧化能力高低顺序依次是水溶性组分＞乙酸乙酯组分＞乙醇组分。其中水溶性组分总抗氧化能力最强，为25.8。

2.2桑黄不同组分清除羟自由基能力测定结果

4种桑黄不同组分清除羟自由基（·OH）能力的测定结果见表2。

表2　桑黄不同组分清除羟自由基（·OH）能力测定结果（±s，n=5）Table 2　The scavenging activities of Phellinus igniarius on hydroxyl radical（±s，n=5）

表2　桑黄不同组分清除羟自由基（·OH）能力测定结果（±s，n=5）Table 2　The scavenging activities of Phellinus igniarius on hydroxyl radical（±s，n=5）

注：**与水溶性组分比较，P＜0.01。

桑黄不同组分　清除率/%石油醚组分乙酸乙酯组分乙醇组分水溶性组分104.8±1.33** 90.19±0.87** 86.43±0.56** 28.18±0.27

清除羟自由基（·OH）能力的高低顺序依次是石油醚提取物＞乙酸乙酯提取物＞乙醇取物＞水提取物，其中石油醚提取物清除羟自由基能力最强。

2.3桑黄不同组分清除超氧阴离子（O2-·）能力测定结果

4种桑黄不同组分清除超氧阴离子（O2-·）能力的测定结果见表3。

表3　桑黄不同组分物清除超氧阴离子（O2-·）能力测定（±s，n=5）Table 3　The scavenging activities of ten kinds of Phellinus igniarius on superoxide anion（±s，n=5）

表3　桑黄不同组分物清除超氧阴离子（O2-·）能力测定（±s，n=5）Table 3　The scavenging activities of ten kinds of Phellinus igniarius on superoxide anion（±s，n=5）

注：*与水溶性组分比较，P＜0.05。

桑黄不同组分　清除率/%石油醚组分乙酸乙酯组分乙醇组分水溶性组分41.04±0.19* 28.18±0.12* 52.38±0.42* 6.58±0.12

清除超氧阴离子（O2-·）能力的高低顺序依次是乙醇提取物＞石油醚提取物＞乙酸乙酯提取物＞水提取物。

3　结论与讨论

研究报道桑黄石油醚组分中有二十碳烷、二十六碳烷、9，12-十八碳二烯酸甲酯、棕榈酸、二丁基羟基甲苯、类固醇木脂素（+）-松脂醇、麦角甾醇过氧化物［11-13］。乙酸乙酯组分中有柚皮素、樱花亭、二氢茨非素、7-甲氧基二氢茨非素、北美圣草素、香豆素、莨菪亭、4-乙烯基苯酚、甲基苯醌、4-乙烯基间苯二酚［14-15］。乙醇组分中有桑黄黄酮A、桑黄黄酮B、桑黄素C，桑黄素D，二聚桑黄素，桑黄素J［16-17］。水溶性成分中有多糖、芳香酸、三萜酸、落叶松蕈酸、虫草酸、脲酶、过氧化氢酶、酯酶、木糖氧化酶、聚酚类等成分［17］。

本研究结果表明，4种桑黄不同组分体外总抗氧化能力高低顺序依次是：水溶性组分＞乙酸乙酯组分＞乙醇组分。水溶性组分总抗氧化能力最强，为25.8。提示桑黄中水溶性成分多糖、芳香酸、三萜酸、落叶松蕈酸、虫草酸、脲酶、过氧化氢酶、酯酶、木糖氧化酶、聚酚类等成分在总抗氧化活性中可能某种或几种有一定的贡献，不一定就是多糖成分在起作用。其中的活性差异还需进一步通过单一物质进行对比研究。需要注意的是，在清除羟自由基（·OH）试验中发现石油醚组分对羟自由基清除能力最强，远远高于水溶性成分，乙酸乙酯组分和乙醇组分也很强。在清除超氧阴离子（O2-·）试验中发现乙醇组分活性最高，石油醚组分次之。这些结果提示桑黄中非多糖成分也是桑黄的重要活性成分。在今后的研究中更需研究这几类成分。

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Comparative Analysis of the Antioxidant Activity of the Different Components from Phellinus igniarius

YANG Li-wei1，YANG Hong-peng2，QUE Sheng3，BAN Li-tong2，*（1.Forestry and Fruiter Institute of Tianjin，Tianjin 300384，China；2.Tianjin Agricultural College，Tianjin 300384 China；3.Department of Chemistry，Teachers College for Nationalities，Qinghai Normal University，Xining 810008，Qinghai，China）

FRAP method，pyrogallol antioxidation method and salicylic acid method were used to determine the antioxidant activities of the different components from Phellinus igniarius.The results suggested that the total antioxidant capacity order from strong to weak was as followes：water soluble fractions＞ethyl acetate fractions＞ethanol fractions.In the scavenging of hydroxyl radical（·OH），the highest scavenging capacity of the petroleum ether fraction was found in the experiment.Ethyl acetate fractions and ethanol fractions were also very strong in the scavenging of hydroxyl radical（·OH）.In the scavenging activities on superoxide anion free radical（O2-·），the scavenging capacity of ethanol fractions was the highest.The second was petroleum ether fractions in the scavenging activities of superoxide anion free radical（O2-·）.These results suggested that the non polysaccharide component in Phellinus phellinus were important.In future research，the study of these components should be studied more.

Phellinusigniarius；antioxidation；comparativeanalysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.048

杨丽维（1981—），女（汉），助理研究员，硕士，主要从事农产品加工方面的研究工作。

2015-09-11