双酶法制备牡蛎抗氧化酶解液的工艺优化

李园，刘艳，段振华（海南大学食品学院，海南海口570228）

双酶法制备牡蛎抗氧化酶解液的工艺优化

李园，刘艳，段振华*
（海南大学食品学院，海南海口570228）

以牡蛎肉为原料，用无花果蛋白酶和风味蛋白酶水解牡蛎肉制备抗氧化酶解液，以DPPH·清除率、氨基酸态氮含量和蛋白质回收率为指标进行单因素和正交试验，探究总酶量、pH、酶解时间和酶比对酶解效果的影响。得到双酶制备牡蛎抗氧化酶解液的最佳工艺条件为：总酶量12%，pH6.0，酶解时间3.0 h，无花果蛋白酶与风味蛋白酶的比例为5∶1（质量比）；该酶解液具有较高抗氧化活性和蛋白质回收率，其氨基酸态氮含量为0.223 g/100 mL，DPPH·清除率可达89.42%、蛋白质回收率达到了79.81%。

风味蛋白酶；无花果蛋白酶；牡蛎；抗氧化活性

牡蛎（Oyster）俗称蚝、海蛎子，牡蛎肉中含有丰富的蛋白质、活性肽、糖原、牛磺酸、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA），具有重要的食用价值和药用价值［1］。以牡蛎肉为原料，通过酶解制取的生物活性肽、活性多糖、优质蛋白质、氨基酸及多种维生素、矿物质等营养成分易于人体的消化吸收。研究发现牡蛎肉酶解产物有很好的降血压［2］、降血脂［3］、醒酒护肝［4］、抗氧化［5］以及抗癌效果［6］。在加工海洋保健功能制品方面，具有诱人的发展前景［7］。牡蛎抗氧化活性肽的制备，主要是单酶水解和双酶水解，由于蛋白酶对肽键作用的专一性，因此仅采用单酶水解，水解度较低。复合酶解的方法有较好的酶解效果，因此本文采用无花果蛋白酶与风味蛋白酶的复合酶解，根据不同酶对肽键的酶切位点的不同，避免了水解度过低的问题，并根据优化试验得到较高抗氧化活性的酶解液，为开发牡蛎功能性食品提供了重要参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

长牡蛎（Crassostrea gigas）：海口市沿江三西路农贸市场；花果蛋白酶（酶活力1.0×105U/g）：河南百盛化工产品有限公司；风味蛋白酶（酶活力1.5×104U/g）：江苏锐阳生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。1.2仪器与设备

HH-S26S电热恒温水浴锅：金坛市大地自动化仪器厂；1085-1恒温磁力搅拌器：金坛市富华仪器有限公司；EL204电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；PHS-3C型实验室pH计：上海伟业仪器厂；TDZ5-WS多管架自动平衡离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；722可见分光光度计：上海奥谱勒仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1氨基酸态氮的测定

氨基酸态氮含量测定：中性甲醛电位滴定法［8］。

1.3.2DPPH·清除率的测定

取牡蛎酶解上清液2 mL，加入2×10-4mol/L DPPH乙醇溶液2 mL，混匀后在室温下避光反应30 min，在517 nm下测定吸光度Ai，样品组以等体积无水乙醇溶液代替DPPH溶液，测定吸光度Aj，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液，并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零，平行测3次取平均值［9］。

式中：A0为对照组吸光度；Ai为样品组吸光度；Aj为空白组吸光度。

1.3.3蛋白质回收率

蛋白质含量的测定：采用GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法。

式中：m为酶解液中蛋白质含量，g/100 g；M为蛋白质总量，g/100 g。

1.3.4牡蛎水解条件的优化

1.3.4.1工艺流程

新鲜牡蛎肉→清洗→匀浆→调料水比（1∶2，g/mL）→调pH→加酶→50℃保温下酶解→灭酶（95℃～100℃，10 min）→离心（6 000 r/min，15 min）→取上清液即酶解液→指标测定

1.3.4.2单因素试验

单因素及其水平为：总酶量（6%、8%、10%、12%、14%）、酶比（无花果蛋白酶∶风味蛋白酶=5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5，均为质量比）、酶解时间（1、2、3、4、5 h）、pH （5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）。采取控制变量法，按上述设计的不同水平值依次进行，与此同时另外3个因素取中间水平，分析单因素各水平对酶解液的氨基酸态氮含量以及DPPH·清除率的影响。

1.3.4.3酶解工艺条件的优化

利用正交试验对单因素试验结果进行条件优化，并添加蛋白质回收率这一指标，确定制备酶解液的最佳条件。采用四因素三水平L9（34）正交表，正交试验的因素和水平见表1。

表1　正交试验因素与水平Table 1　Orthogonal test factors and levels

2　结果与分析

2.1总酶量对牡蛎酶解液的氨基酸态氮含量和DPPH·清除率的影响

在酶解底物pH为6.5，无花果蛋白酶与风味蛋白酶的比例为1∶1（质量比），总酶量分别为6%、8%、10%、12%、14%，在50℃酶解3.0 h，总酶量对酶解效果的影响见图1。

图1　 总酶量对DPPH·清除率和氨基酸态氮含量的影响Fig.1　The effect of enzyme dosage on amino acid-nitrogen and DPPH radical scavenging activity

由图1可知，氨基酸态氮含量随着酶量的增加呈现先上升后下降的趋势，在总酶量10%～12%，氨基酸态氮含量上升趋势加快，说明此时总酶量与底物浓度成正比反应，反应速率逐渐增加。而总酶量达12%后，大量产生的水解产物可能影响酶的活性，因此氨基酸态氮含量也急剧下降；DPPH·清除率随总酶量的增加而逐渐增加，当总酶量超过10%，DPPH·清除率开始不断下降，可能是由于水解过度，肽进一步水解变成游离氨基酸导致的［11］。此外，总酶量增加到一定量时，酶分子间碰撞的机会增加，可能还会引起酶自溶，不利于反应的进行，同时也增加了生产成本［12］，因此总酶量10%是单因素的最佳条件。

2.2不同pH对牡蛎酶解液的氨基酸态氮含量和DPPH·清除率的影响

在总酶量10%，无花果蛋白酶与风味蛋白酶的比例为1∶1（质量比），50℃酶解3.0 h的情况下，酶解底物pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，pH对酶解效果的影响见图2。

图2　pH对DPPH·清除率和氨基酸态氮含量的影响Fig.2　The effect of pH on amino acid-nitrogen and DPPH radical scavenging activity

由图2可知，随着pH升高，氨基态氮含量与DPPH·清除率都呈先增后降的趋势，两种酶都是中性酶［13-14］，因此在中性条件下对牡蛎水解效果最好；不同的是两指标开始下降的点有差异，可能由于pH过了6.5水解程度较高，导致肽过多分解为氨基酸，根据郭冬青等［15］的研究，pH6.5是无花果酶活性最稳定条件，综合考虑选择pH6.5为最适pH。

2.3不同时间对牡蛎酶解液的氨基酸态氮含量和DPPH·清除率的影响

在酶解底物pH6.5，无花果蛋白酶与风味蛋白酶的比例为1∶1（质量比），酶总量10%的前提下，在50℃下分别酶解1、2、3、4、5 h，结果如图3所示。

图3　时间对DPPH·清除率和氨基酸态氮含量的影响Fig.3　The effect of time on amino acid-nitrogen and DPPH radical scavenging activity

由图3可知，随时间的增加氨基酸态氮含量呈逐渐增加的趋势，但在3 h之前增长速率较快，之后逐渐平稳但并没有下降的趋势，说明时间越长酶解程度越高，但在3 h后变化不明显，有可能是酶与底物浓度接近饱和状态；DPPH·清除率同样在3 h后增长趋势发生变化，但先平缓后下降，其原因可能是酶解时间过长将增加多肽水解成氨基酸的可能性，失去了清除自由基的能力［13］，因此酶解最适时间选择3 h。

2.4不同加酶比对牡蛎酶解液的氨基酸态氮含量和DPPH·清除率的影响

在酶解底物pH6.5，总酶量10%，50℃酶解3 h的条件不变，分别以质量比为5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5的比例加入无花果酶和风味蛋白酶，结果见图4。

图4　双酶酶比对DPPH·清除率和氨基酸态氮含量的影响Fig.4　The effect of proportion of two enzymes on amino acidnitrogen and DPPH radical scavenging activity

如图4所示，无花果蛋白酶比例较风味蛋白酶多的时候对DPPH·清除率影响较大，随着无花果酶比例的减少，清除率直线下降，但对风味蛋白酶的比例增大并不敏感；而氨基酸态氮含量则对风味蛋白酶高比率的条件较敏感，说明风味蛋白酶高比率的时候，肽多被水解成游离氨基酸，因此DPPH·清除率变化情况很小，而氨基酸态氮含量较高。同样也验证了两种酶的切割位点不同且互补达到了较高的水解度，但综合考虑两个指标，在无花果酶比率较高时两个指标的结果都是比较高的，因此选择无花果蛋白酶与风味蛋白酶质量比为5∶1作为单因素最适酶比。

2.5正交试验数据及其分析

正交试验因素水平与直观分析表，见表2。

根据表2的极差R1、R2、R3表示影响各指标的各因素主次顺序，根据各试验因子的平均值选取较优水平。

根据表2分析的最优水平以及主次影响可知，总酶量对蛋白质回收率和氨基酸态氮含量的影响较大，因此选择总酶量为12%；pH对DPPH·清除率影响最大，因此优先选择其指标中的最优水平即pH6.0；酶解时间对氨基酸态氮含量影响最大，故选择酶解时间为3.0 h；酶比对蛋白质回收率影响最大，故选择酶比为5∶1（质量比）。因此双酶法制备牡蛎抗氧化酶解液的最佳工艺条件为A3B1C2D1，即总酶量12%，pH6.0，酶解时间3.0 h，无花果蛋白酶与风味蛋白酶的比例为5∶1（质量比）。

对最优水平组合A3B1C2D1进行验证试验，制备的牡蛎酶解液的氨基酸态氮含量为0.223 g/100 mL，DPPH·清除率为89.42%，蛋白质回收率为79.81%，其中DPPH·清除率与蛋白质回收率都明显高于正交试验所得到的所有数据，说明该优化试验具有可行性，能有效提高酶解液的抗氧化活性和蛋白质回收率。

表2　正交试验因素水平与直观分析表Table 2　The orthogonal factors level and intuitive analysis table

3　结论

以牡蛎酶解液中氨基酸态氮的含量、DPPH·清除率以及蛋白质回收率为指标，得到双酶（无花果蛋白酶和风味蛋白酶）复合制备牡蛎酶解液的最佳工艺条件为：加酶量12%，pH 6.0，酶解时间3.0 h，酶比（无花果蛋白酶：风味蛋白酶）5∶1（质量比）。在此条件下，牡蛎酶解液氨基酸态氮的含量为0.223 g/100 mL、DPPH·清除率达89.42%、蛋白质回收率达到79.81%。选择无花果蛋白酶与风味蛋白酶的复合酶解技术对牡蛎肉进行水解，能有效提高牡蛎酶解液的抗氧化活性和蛋白质回收率。并为无花果蛋白酶和风味蛋白酶的复合酶解技术奠定了基础，为牡蛎酶解产生的活性肽等产物的利用和保健食品的开发提供了条件。

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Optimal Hydrolysis Process for Preparing Oyster Antioxidant Hydrolysates with Two Enzymes

LI Yuan，LIU Yan，DUAN Zhen-hua*
（College of Food Science and Engineering，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

In order to prepare oyster antioxidant hydrolysates，the oyster meat was hydrolyzed with flavourzyme and ficin simultaneously.The effects of enzyme dosage，pH，hydrolysis time and proportion of two enzymes on the hydrolysis were investigated by single-factor tests and orthogonal tests，and the indicators were protein recovery，DPPH radical scavenging activity and amino acid-nitrogen content.The optimal hydrolysis conditions were enzyme dosage 12%，pH6.0，hydrolysis time 3.0 h，and the proportion of ficin and flavourzyme were 5∶1 （mass ratio）.Under such conditions，the hydrolysates exhibited higher antioxidant activity and protein recovery. The content of amino acid-nitrogen up to 0.223 g/100 mL，DPPH radical scavenging rate reached 89.42%and the recovery of protein was 79.81%.

flavourzyme；ficin；oyster；antioxidantactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.028

国家“十二五”科技支撑计划（2013BAB01B04）；海南省科技兴海专项（XH201308）

李园（1993—），女（汉），大学本科，主要从事水产品食品科学技术研究工作。

2015-08-14