几种耐高温淀粉酶的酶活影响因素研究

郑美娟，郭金玲，余华顺，姚鹃，龚大春，*（.三峡大学生物与制药学院，湖北宜昌44300；.安琪酵母股份有限公司酵母功能湖北省重点实验室，湖北宜昌44300）

几种耐高温淀粉酶的酶活影响因素研究

郑美娟1，郭金玲1，余华顺2，姚鹃2，龚大春1，*
（1.三峡大学生物与制药学院，湖北宜昌443002；2.安琪酵母股份有限公司酵母功能湖北省重点实验室，湖北宜昌443002）

淀粉酶是食品、发酵行业应用最广泛的酶种之一。从最适温度、最适pH值、保存温度、缓冲溶液pH值等方面对5种不同的耐高温α-淀粉酶酶活的影响进行了研究。结果表明：耐高温α-淀粉酶B的耐酸性最好，在pH4.00～7.50之间，相对酶活为98%～100%；耐高温淀粉酶A的耐高温性最好，在反应温度70℃～100℃之间，相对酶活为100%～121%；耐高温α-淀粉酶A的缓冲溶液稳定性最好，在缓冲溶液pH4.50～7.00之间，酶活维持在91%～100%；耐高温α-淀粉酶E温度稳定性质最好，在储存温度30℃～60℃之间，相对酶活为98%～100%。为淀粉酶的选择奠定基础。

耐高温α-淀粉酶；酶活；影响因素

α-淀粉酶是目前国际市场上非常热门的酶制剂之一，被广泛应用于淀粉加工、酒精制造、味精、酱油、造纸等行业。近年来，随着现代工业技术的发展，以淀粉为原料的成品愈来愈多，淀粉原料在深加工中所处的反应环境也变得苛刻，如高温、强酸、强碱等［1-3］。原有的淀粉酶会造成原料的利用率低，化学工艺复杂，下游处理繁琐等。因此开发新型的耐酸性高温α-淀粉酶具有重要的前景意义［4-9］。目前市场的行业领导者是美国的杰能科和丹麦诺维信α-淀粉酶产品，酶活高且对工业生产的各种酸环境和高温都能有很强的耐受性。我国市场上的α-淀粉酶的种类繁多，但是品质参差不齐，在液化和糖化的效果上与国际主流的几个淀粉酶制剂公司差距较大，因此对市场上的耐酸性高温α-淀粉酶的酶学性质进行研究，能够清楚了解整个α-淀粉酶行业的现状，对企业菌种的研发，淀粉酶的生产，合理的销售目标，准确的市场定位均具有重要的意义。

1　材料与方法

1.1试剂及仪器

A、B、C、D、E、F公司的耐酸性高温α-淀粉酶、淀粉、醋酸（分析纯AR）、十二水磷酸氢二钠（分析纯AR）、柠檬酸（分析纯AR）、碘化钾（分析纯AR）、0.1 mol/L盐酸、0.1 mol/L氢氧化钠（分析纯AR）、无水乙醇（分析纯AR）、考马斯亮蓝（分析纯AR）、牛血清蛋白：天津市科密欧化学试剂有限公司。

20RP-52D自动高速冷冻离心机：日本日立公司；NH-4数显恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司；pHS-25酸度计：上海雷磁仪器厂；ZD-2型自动电位滴定仪：上海雷磁仪器厂；TG16A-WS离心机：上海卢湘仪器厂；721W型分光光度计：上海仪器分析厂。

1.2方法

1.2.1蛋白质标准曲线的测定

准确吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的牛血清蛋白标准溶液于试管中，然后用无离子水补充到1 mL，最后每支试管加入5.0 mL考马斯亮蓝G-250试剂，每次添加之后立即用漩涡混合器振荡混合，反应5 min后在595 nm波长的分光光度计测量其吸光值，空白对照为含0.0 mL的牛血清蛋白试管。

1.2.2酶液蛋白质含量测定

准确稀释酶液，使吸光值在合理的区间（0.100～0.768），吸取1.00 mL的稀释酶液，加入5.00 mL的考马斯亮蓝染料试剂，空白样加1.00 mL双蒸水和5.00 mL的考马斯亮蓝染料试剂，在5 min～10 min内在595 nm波长下测量吸光值，根据标准曲线计算出蛋白质含量。

1.2.3耐酸性高温α淀粉酶酶活测定

耐酸性高温α淀粉酶酶活采用分光光度法测定。

1.2.4α-淀粉酶理化性质研究方法

1.2.4.1pH值稳定性

设计酶液 pH值梯度为 4.00、4.50、5.00、5.50、6.50、7.00、7.50。取耐酸性高温淀粉酶约40 mL，分别用20%的乙酸和0.01 mol/L的氢氧化钠调制酶液至所需pH值，置于30℃保存18 h后稀释国标检测酶活。计算酶活力收率。

1.2.4.2最适反应温度

最适反应温度设计梯度为60、70、80、90、95、100℃，将酶液在pH为6.0的缓冲溶液中，在梯度温度下进行测量，计算酶活力收率。

1.2.4.3最适作用pH值

用十二水合磷酸氢二钠、柠檬酸配置缓冲溶液，pH值梯度为4.50、5.00、5.50、6.00、6.50、7.00，采用国标检测酶活。

1.2.4.4温度稳定性

取适量的样品在试验梯度为40、45、50、60℃温度下保存3 d，采用国标检测酶活，计算酶活收率。、

1.2.5酶活测定步骤

1）吸取可溶性淀粉溶液20.0 mL于试管中，加入磷酸缓冲液5.00 mL，摇匀后，于70℃恒温水浴锅中预热5 min

2）加入稀释好的待测酶液1.00 mL，立即计时摇匀，准确反应5 min

3）反应时间终止，立即吸取反应液1.00 mL，加入到预先盛有0.5 mL盐酸溶液和5.00 mL稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5 mL的盐酸和5.00 mL稀碘液的作为空白样，于660 nm波长下，用比色皿迅速测定器吸光度A，根据吸光度表求得测试酶的浓度C。

酶活：耐高温α-淀粉酶X=C×n/16.67

式中：C为测试酶液的浓度，μ/g；n为样品的稀释倍数；16.67为根据酶活定义计算的换算系数。

1.3蛋白质相对分子质量测定

采用SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量。

2　结果与结论

2.1不同pH值对淀粉酶活性影响

不同的pH值对淀粉酶活的影响见图1。

将这6种耐酸性高温α-淀粉酶在pH值梯度4.00～7.50的酶活变化总结在一个表中可以清楚的了解各种酶之间对耐酸性的程度大小。其中B、C、D这3种酶的耐酸性都强，普遍的适合淀粉生产的强酸环境，A、E、F这3种酶在pH5.00以下的环境中酶活影响较大，不太适合更强酸环境的生产中使用。

3.2最适反应温度

不同温度对淀粉酶酶活的影响见图2。

由图2可知，这几种高温淀粉酶，在70℃之前，温度对酶活的影响基本相同，但是在70℃以后，温度对酶的影响渐渐呈现出来，A、F这两种酶在高温的环境中更能发挥催化作用，酶活能超过国标中测定的酶活，在淀粉酶的液化当中，可以更加的发挥作用；B、C、D、E这几种酶在高温的时候，酶活下降的趋势都比较明显，有些的变化趋势和中温淀粉酶的趋势一样，在实际的生产中，要达到同样的液化效果，所需要的酶剂量要更大。

图1　不同的pH对淀粉酶活的影响Fig.1　The effect of different pH on the enzymatic activity of amylase

图2　不同温度对淀粉酶酶活的影响Fig.2　The effect of different temperature on the enzymatic activity of amylase

3.3缓冲溶液对酶活的影响

缓冲溶液的不同pH对各种酶活的影响见图3。

图3　 缓冲溶液的不同pH值对各种酶活的影响Fig.3　The effect of different pH on the enzymatic activity of amylase in buffer solution

缓冲溶液时保证反应的的时候，整个反应液体系中pH稳定性，如图3所示，F酶活在缓冲溶液的低pH值的时候有较大的影响，B、C、D、E这4种酶活在6.5～7.00区间内，酶活有较大幅度的下降，其中的具体原因有待研究。

3.4保存温度对酶活的影响

保存温度对各种酶活的影响见图4。

图4　 保存温度对各种酶活的影响Fig.4　The effect of the storage temperature on the enzymatic activity of amylase

由图4分析可知，温度对各种酶活的影响均不同，在45℃以下酶活均为出现较大的变化。但是在此之后，各种酶由于本身的特性，酶活开始出现下降，特别是A、B酶，保存温度对其酶活的影响较大。因此，为了防止α-耐酸性高温淀粉酶的热变性，应该放置低温保存。

3.5耐酸性高温淀粉酶中蛋白质的含量

3.5.1蛋白质标准曲线

蛋白质标准曲线见图5。

图5　 蛋白质标准曲线Fig.5　The standard curve of the protein

由图5可见，蛋白浓度标准曲线呈一条直线，曲线方程为：y=0.505 4x+0.025 6，R2=0.995 6，在蛋白浓度为0～1.0g/L范围内时，随着蛋白质浓度的增加，显色后的光吸收值OD595，线性增加，因此当测定溶液中蛋白浓度时，只要显色后的光吸收值OD595在图中的直线范围内就可以参照标准曲线比较准确的计算出被测溶液的淀粉浓度。

3.5.2A、B、C、D、E、F酶中蛋白质的测定酶液蛋白质含量见表1。

表1　酶液蛋白质含量Table 1　The contain of the protein in the enzymatic liquid

结合各公司的酶活，可以知道酶活的高低和酶含量没有太多的关联，可推测在提取酶液的工艺中不需要追求单位内的酶活大小而特意浓缩酶液，酶的活力的大小与酶的结构和催化位点决定酶活大小。

4　结论

对A、B、C、D、E、F公司耐酸性高温α-淀粉酶的酶学性质研究发现，这6种酶的理化性质有共同的特征，也有不相同的特征。各种酶对耐酸性、耐高温性、保存的温度环境，反应体系液体的缓冲pH表现出来的酶活稳定差异性较大，这决定了在实际的工业生产所使用的领域不同。B公司的耐酸性高温α-淀粉酶的耐酸性最好，在pH4.00～7.50之间，相对酶活为98%～100%；A公司的耐酸性高温淀粉酶的耐高温性最好，在反应温度70℃～100℃之间，相对酶活为100%～121%；A公司的耐酸性高温α-淀粉酶的缓冲溶液稳定性最好，在缓冲溶液pH4.50～7.00之间，酶活维持在91%～100%；E公司的耐酸性高温α-淀粉酶温度稳定性质最好，在储存温度30℃～60℃之间，相对酶活为98%～100%；E公司的蛋白纯化最好，单位蛋白酶活相对最高。

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Study on the Enzymatic Activity Effects of Several Thermostable α-Amylases

ZHENG Mei-juan1，GUO Jin-ling1，YU Hua-shun2，YAO Juan2，GONG Da-chun1，*
（1.College of Biotechnology and Pharmaceutical，Three Gorges University，Yichang 443002，Hubei，China；2.Yeast Function of Hubei Key Lab.，Angel Yeast Co.，Ltd.，Yichang 443002，Hubei，China）

α-Amylase is one of the most extensive enzyme for food and fermentation industry.Several thermostable α-Amylase enzymatic activity effect was studied from the optimal temperature，the optimal pH，the storage temperature and buffer solution pH.The results showed that B company's thermostable α-Amylase acid resistance was preferably with the relative activity of 98%to 100%between 4.00-7.50 pH and A company's thermostable amylase temperature resistance was the best with the relative activity 100%to 121%between 70℃-100℃and the thermostable α-Amylase of Company A buffering ability was the best in a buffer solution pH value between 4.50-7.00 with the activity from 91%to 100%and the E company's α-Amylase have the best temperature stability from 30℃to 60℃storage temperature with the relative activity of 98%to 100%. This research will provide the basis for the select of α-Amylase.

thermostableα-Amylase；enzymaticactivity；effect

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.013

郑美娟（1977—），女（汉），讲师，硕士研究生，从事生物学的教学与研究。

龚大春（1967—），教授，博士，从事生物催化与生物能源的研究与开发。

2015-08-25