五味子乙素对脑胶质瘤细胞U87增殖的影响及其机制探讨

吕红，苏子博，付仁，郑立影，潘正，齐玲，金宏

(吉林医药学院临床医学院，吉林吉林 132013)



·论著·

五味子乙素对脑胶质瘤细胞U87增殖的影响及其机制探讨

吕红，苏子博，付仁，郑立影，潘正，齐玲，金宏

(吉林医药学院临床医学院，吉林吉林 132013)

目的观察五味子乙素(Sch B)对脑胶质瘤细胞U87增殖的影响，并探讨其可能机制。方法培养U87细胞，分为A、B、C、D组，D组加入含5%血清的培养液200 μL，A、B、C组分别加入含50、100、200 μg/mL Sch B的等量培养液，比较各组细胞增殖情况、细胞周期及细胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2。结果与D组比较，A、B、C组48 h和72 h的细胞OD值降低(P均<0.05)。与A、D组比较，B组Caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2的A值及阳性表达率高(P均<0.05)。与D组比较，C组Caspase-3、Bax/Bcl-2的A值及阳性表达率高(P均<0.05)。与A组相比，C组Caspase-3的A值及阳性表达率高(P均<0.05)。与D组比较，A组G1期、G2/M期细胞比例增加,P均<0.05。结论Sch B能明显抑制U87细胞增殖，诱导其凋亡，且呈一定的量效关系；其机制可能与上调细胞Caspase-3、Bax、Bcl-2表达有关。

五味子乙素；脑胶质瘤；Caspase-3蛋白；Bax蛋白；Bcl-2蛋白

脑胶质瘤是常见的颅内肿瘤，由于肿瘤所在位置极为特殊，对人体的影响和危害很大。目前，对于脑胶质瘤的治疗以手术和化疗为主，但化疗药物不良反应大，且易产生耐药性[1]。五味子为木兰科植物，具有保肝、抗氧化、抗衰老等作用，是一种上品中药。研究[2～5]表明，五味子具有一定的抗肿瘤活性，乙素则是其中的一种抗肿瘤有效成分，其通过多种途径发挥着作用。本研究观察了五味子乙素(Sch B)对脑胶质瘤细胞U87增殖的影响，并探讨其可能机制。

1　材料与方法

1.1细胞株、药物及试剂U87细胞由吉林大学提供。Sch B，白色结晶，用DMSO配成浓度20 mg/mL备用，置于4 ℃冰箱保存，实验时再用高糖培养液稀释至所需浓度。DMEM培养基 (Thermo公司)，胎牛血清(FBS，Gibco公司)，胰蛋白酶(EDTA，Gibco公司)，二甲基亚砜(DMSO，Thermo公司)。Caspase-3、Bax、Bcl-2抗体(北京中杉金桥生物技术公司)。

1.2U87细胞培养将U87细胞接种于含FBS浓度为10%的DMEM高糖细胞培养基中，在37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，每隔1 d换液1次。

1.3U87细胞增殖情况观察采用MTT法。取对数生长期U87细胞，接种于平底96孔板中，使细胞数为1×104/孔。培养24 h使细胞同步化后分为A、B、C、D组，D组加入含5%血清的培养液200 μL，A、B、C组分别加入含50、100、200 μg/mL Sch B的等量培养液，各组作用24、48、72 h后弃上清。用MTT还原法在酶标仪490 nm波长处检测各孔光密度值(OD值)，用不加细胞的空白孔调零。

1.4U87细胞Caspase-3、Bax、Bcl-2检测①ELISA法:将生长状态良好的U87细胞接种于放有无菌玻片的24孔板中，分为A、B、C、D组，D组加入含5%血清的培养液200 μL，A、B、C组分别加入含50、100、200 μg/mL Sch B的等量培养液，作用72 h，每组5个复孔。取培养上清，与包被液以1∶1比例加入96孔酶标板，4 ℃过夜。37 ℃封闭1.5 h，加入Caspase-3、Bax和Bcl-2抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜。次日加入二抗(1∶1 000稀释)室温孵育1.5 h，DAB避光显色，有颜色变化时终止，于酶标仪490 nm波长处测定吸光度值(A值)。②免疫组化法:分组及各组干预方法同上，作用72 h后吸出上清，10%甲醛固定30 min，空气干燥；内源性过氧化物酶灭活；一抗4 ℃过夜，滴加试剂1，37 ℃、20 min，加试剂2，37 ℃、30 min，DAB溶液显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。镜下观察，以细胞质中呈弥漫性分布黄色到棕褐色颗粒定义为阳性，计数Caspase-3、Bax、Bcl-2表达阳性细胞，阳性表达率=(阳性细胞数/总细胞数)×100%。

1.5U87细胞周期观察采用流式分析仪。取对数生长期U87细胞，1×106接种于细胞培养瓶中，24 h后加入Sch B(浓度为200、0 μg/mL)，分别计为A、D组，继续培养48 h。消化后用80%冷甲醇固定过夜，经Annexin V/PI染色，上机检测各组细胞周期。

2　结果

2.1各组细胞OD值比较细胞OD值见表1。

表1　各组细胞OD值比较

注：与D组比较，△P<0.05。

2.2各组细胞Caspase-3、Bax、Bcl-2 A值及阳性表达率比较细胞Caspase-3、Bax、Bcl-2 A值及阳性表达率比较见表2。

表2　各组细胞Caspase-3、Bax、Bcl-2 A值及阳性表达率比较

注：与D组比较，△P<0.05；与A组比较，※P<0.05。

2.3两组细胞周期比较A组和D组G1期细胞分别为8.10%、3.12%，G2/M期细胞分别为16.17%、12.28%，两组比较，P均<0.05；A组和D组G0/G1期细胞分别为52.37%、58.95%，S期细胞分别为23.36%、25.65%，两组比较，P均>0.05。

3　讨论

脑胶质瘤是恶性程度较高的原发性肿瘤，在中枢神经系统最常见，约占颅内肿瘤的45%[6]。恶性胶质瘤生长呈浸润性，边界不清楚，手术难根除，具有发病率、复发率、病死率高和治愈率低的特点，目前没有满意的治疗方法[7]。齐玲等[8,9]通过对人新鲜脑肿瘤标本进行分离，直接培养，获得脑肿瘤干细胞；这种干细胞的存在可能是导致脑肿瘤发生、耐药以及复发的根源。

五味子是常用的滋补固涩类中药，性味温和，具补益强壮之功、奏固涩生津之效，对心、肝、脾、肺、肾发挥平衡作用[10]，能明显影响机体多种组织器官的生物学活性[11]。Sch B作为五味子的主要活性成分之一，在抗肿瘤方面发挥重要作用[12,13]。最近研究[14]发现，Sch B低、中、高剂量组均可抑制结肠癌SW480细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡，其机制可能是通过激活p38MAPK/p53信号通路来参与抗肿瘤作用。Sch B联合顺铂对H22肿瘤的抑制作用比单独应用时效果更强，具有一种类似正反馈的作用使细胞凋亡，其抗瘤作用与抑癌基因p53的高表达相关[15]。Sch B对多柔比星使用过程中产生的心脏毒性有限制作用，同时显著增强DOX诱导SMMC7721、MCF-7的凋亡能力[16]。Sch B还能通过调节相关凋亡蛋白Bax、Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、NF-κB、PARP、CDK-4的表达来引导胆囊癌细胞凋亡[17]。

本课题组前期研究[18]发现，高浓度Sch B能够抑制U87细胞的增殖，但并未进一步研究其机制。Caspase-3是凋亡过程中最关键的执行蛋白酶，起着最终枢纽作用[19]。Bcl-2也是一个调解细胞凋亡的重要基因，其表达升高可抑制细胞凋亡。而Bax的作用与Bcl-2相反，二者产生负反馈作用，影响细胞存活，通过二者的比值，可了解细胞的生存状况[20]。本研究显示，与D组比较，A、B、C组细胞OD值降低，Caspase-3、Bax、Bcl-2 A值及阳性表达率升高，G1期及G2/M期细胞比例高。提示Sch B能明显抑制U87细胞增殖，诱导其凋亡，且呈一定的量效关系；其机制可能与上调Caspase-3、Bax、Bcl-2表达有关。

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Influence of Schisandrin B on proliferation of glioma U87 cells and its mechanism

LYU Hong, SU Zibo, FU Ren, ZHENG Liying, PAN Zheng, Qi Ling, JIN Hong

(Clinical Medical College of Jilin Medical College, Jilin 132013, China)

Objective To investigate the effect of Schisandrin B (Sch B) on the proliferation of glioma U87 cells and to explore its possible mechanism. MethodsGlioma U87 cells were cultured and were divided into groups A, B, C and D. Group D was added with culture solution that containing 5% serum 200 μL, and groups A, B and C were added with the same amount of nutrient solution which respectively contained 50, 100 and 200 μg/ml Sch B. The cell proliferation was compared between these groups. The cell cycle and the expression of Caspase-3, Bax, Bcl-2 and Bax/Bcl-2 were respectively detected by ELISA and immunohistochemistry. ResultsCompared with group D, the A value at 48 h and 72 h in the groups A, B and C was decreased. Compared with groups D and A, the A values of Caspase-3, Bax and Bax/Bcl-2 and the positive expression rate of group B were increased (all P<0.05). Compared with group D, the A values of Caspase-3 and Bax/Bcl-2, and the positive expression of group C were increased (all P<0.05). Compared with group A, the A value of Caspase-3 and the positive expression rate of group C were increased (all P<0.05). Compared with group D, the cell percentage of the G1 and G2/M phases of group A was increased, all P<0.05. ConclusionSch B can significantly inhibit the proliferation of U87 cells, induce the apoptosis, and it has a dose-effect relationship, whose mechanism may be related with the up-regulation of Caspase-3, Bax and Bcl-2 expression.

Schisandrin B; glioma; Caspase-3 protein; Bax protein; Bcl-2 protein

吉林省大学生创新创业训练计划项目(2014039)；吉林省教育厅“十二五”科学技术研究规划项目(吉科教合字2015第408号)。

吕红(1992-)，女，本科，主要研究方向为脑肿瘤药物。E-mail: lvhong1026@163.com

简介：金宏(1975-)，女，硕士，副教授，主要研究方向为脑肿瘤药物。E-mail: jinhong0706@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.001

R739.4

A

1002-266X(2016)15-0001-03

2015-11-09)