水稻粳粳交后代花药培养技术的初探

段　敏，谢留杰，唐兴国，黄善军，潘晓飚*（.台州市农业科学研究院作物研究所，浙江临海 37000；.台州市作物遗传育种重点实验室，浙江临海 37000）

水稻粳粳交后代花药培养技术的初探

段敏1，2，谢留杰1，唐兴国2，黄善军1，潘晓飚1，2*
（1.台州市农业科学研究院作物研究所，浙江临海 317000；2.台州市作物遗传育种重点实验室，浙江临海 317000）

以甬粳13-54/丙13-07和甬粳13-54/丙04-08（分别编号F2-17和F2-19）2个水稻粳粳交F2代为试验材料，通过改变培养基中碳源、有机营养物、激素、活性炭等成分配比，建立一套适用于本生态区粳稻育种材料的花药培养体系。结果表明，M 8+6%麦芽糖+2 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-1KT+1 mg·L-1NAA+ 100 mg·L-1脯氨酸+500 mg·L-1谷氨酰胺+100 mg·L-1水解酪蛋白为诱导培养基效果较好，2种材料的花药诱导率分别为5.56%和12.74%；分化培养基中KT∶6-BA=1∶4时可促进愈伤组织萌发出更多的绿点，绿点率可达47.42%。另外无论是愈伤组织诱导率还是绿点萌发均显示F2-19的花药培养效率高于F2-17。

水稻；花药；愈伤组织；活性炭；有机营养物

文献著录格式：段敏，谢留杰，唐兴国，等.水稻粳粳交后代花药培养技术的初探［J］.浙江农业科学，2016，57（7）：1045-1049.

植物花药培养技术已成为当今生物技术育种中较为成熟实用的育种技术。自1964年印度德里大学的Guha和Maheshiwari从毛叶曼陀罗花药培养中获得单倍体植株后，相继有烟草、水稻、小麦等植物成功获得单倍体植株［1］。由于单倍体植株经加倍后可以获得纯合二倍体，在育种上可快速获得稳定的遗传后代，故花药培养技术逐渐受到各国育种家的重视，目前在生产实践中已体现出巨大的价值。我国的水稻花药培养技术研究始于20世纪70年代，至今已取得一系列可喜的成果，选育出多个水稻花培品种并被广泛应用［2-3］。除了选育花培品种，水稻花药培养还被成功应用在核质互作雄性不育系的提纯复壮［4-5］、光温敏核不育系的选育［6-8］及品种改良［9］等多个领域中。

尽管水稻花药培养技术水平日益提高，但实际操作中由于基因型差异、培养基种类差异以及培养环境等因素的影响，往往难以获得较大的再生植株群体，使后代选择受到较大的限制［10］。因此，提高花药培养的诱导效率、扩大花培后代群体是水稻花药培育种成败的关键。本研究选择2个水稻粳粳交后代作为试验材料，通过改变诱导培养基碳源、有机营养物、活性炭等成分，探索出一套适用于本生态区粳稻育种材料花药培养体系，为日后该地区水稻育种的发展提供技术支持。

1　材料与方法

1.1供试材料

以甬粳13-54/丙13-07杂交F2代和甬粳13-54/丙04-08杂交F2代2个水稻品系为试材，分别编号为F2-17和F2-19，均由台州市农科院作物所选育，种植于台州市农科院小溪基地。

本试验于2015年9—12月在本院进行。待试验材料生长至孕穗期，剑叶叶枕与倒二叶叶枕距离5 cm左右时，于阳光充沛、天气晴朗的午后从大田中选取健壮无病斑的水稻主茎或第一分蘖幼穗，保留2片叶子，带回实验室用1%的I2-KI溶液镜检。选取小孢子发育处于单核早中期的穗子，经75%乙醇表面擦拭后，用湿纱布及塑料膜包好放入冰箱冷藏（7℃）8～10 d。

1.2花药接种及愈伤组织诱导

将低温处理后的幼穗以枝梗为单位分开，每15～20支为1束浸入次氯酸钠饱和溶液中消毒10～15 min，超净工作台上无菌水冲洗3～4次。在无菌条件下用镊子将花药小心取出，接种于固体培养基上。每个培养皿直径为6 cm，接种花药80～100枚。（26±2）℃条件下暗培养诱导出愈伤组织。

1.3愈伤组织分化和植株再生

待花药膨胀、愈伤组织从花药中长出后，从第25～70天，分次将直径大小在1～3 mm左右的愈伤组织转移至分化培养基中诱导绿苗分化，光照条件为2 000 1x，12 h·d-1，温度设置（26±1）℃。待幼苗长至2～3 cm时移入生根培养基中生根，统计绿苗率及白苗率。待苗长至7～8 cm时，打开瓶盖炼苗3 d，再移入温室。

1.4培养基类型

愈伤组织诱导的培养基以M8为基础培养基，加入6%麦芽糖或3%麦芽糖+3%蔗糖作为碳源。激素种类包括2，4-D（2.0 mg·L-1），KT（0.5 mg·L-1），NAA（1.0 mg·L-1）。以0.3%植物凝胶固化，pH调节至5.8左右。另据需求加入氨基酸、有机营养物、活性炭等。诱导培养基具体成分及含量见表1。

表1　愈伤组织诱导培养基中各营养成分的组合和配比

愈伤分化培养基以MS作为基础培养基，加入6%麦芽糖，脯氨酸100 mg·L-1，谷氨酰胺500 mg·L-1，酸水解酪蛋白100 mg·L-1，并以0.3%植物凝胶固化，调节pH值至5.8左右。激素种类的成分及含量详见表2。

表2　愈伤组织分化培养基中各营养成分的组合和配比mg·L-1

生根培养基的主要成分为1/2 MS基础培养基中加入2%蔗糖，激素种类包括IBA（0.5 mg· L-1）和多效唑（4.0 mg·L-1），另外加入0.3%活性炭，以0.3%植物凝胶固化，pH调节至5.8左右。

所有培养基采用0.11 MPa、121℃高温高压灭菌20 m in，冷却后备用。

1.5统计分析

花药出愈率/%=愈伤组织总数/接种花药数×100；

绿点率/%=出绿点的愈伤数/愈伤组织总数×100；

绿苗率/%=绿苗个数/愈伤组织总数×100；试验数据用Exce1统计软件分析。

2　结果与分析

2.1诱导培养基的成分对花药愈伤组织诱导的影响

试验设计了4种不同成分配比的诱导培养基。从表3可以看出，2种水稻花药在诱导培养基R1、R3上基本未诱导出愈伤组织，在R2、R4培养基上均诱导出愈伤组织。比较R1、R2的结果，说明混合碳源（麦芽糖+蔗糖）的效果优于单一麦芽糖碳源。R3与R4相比，不含活性炭的R4能够诱导出愈伤组织，说明活性炭在诱导过程中不是必须的。综合来看，混合碳源的诱导效果好，而外加有机物（如氨基酸、水解蛋白等）可能与活性炭有所冲突，需避免同时使用。至于混合碳源与有机物同时使用的效果是否优于单一碳源（R4），还需进一步分析。

表3　不同诱导培养基对水稻花药出愈率的影响

2.2分化培养基中激素含量对绿点率及绿苗率的影响

试验设计了2种分化培养基，二者主要不同在于激素KT与6-BA的含量比例有所差异。由于R1、R3上基本没有长出愈伤组织，故以R2、R4诱导培养基上转移的愈伤组织数分析绿点率、绿苗率。

从表4看出，2种分化培养基上的愈伤组织均能萌发出绿点，而D2的绿点率高于D1，说明KT∶6-BA=1∶4的激素比更有利于愈伤组织的分化。大多数愈伤组织转移至分化培养基后会褐化，这是正常现象。但随着时间推移，褐化程度越发严重，使得原本有绿点的部位也随之褐化。试验结果未能得到一株绿苗。

表4　不同分化培养基对水稻花药愈伤组织绿点率的影响

2.3基因型对花药培养效率的影响

供试的2种水稻品系均为粳粳交的F2代，父本相同，母本不同。从表3看出，F2-17的花药在R2上诱导出的愈伤组织较多，F2-19在R4上能够诱导出更多的愈伤组织，说明不同基因型的花药培养效率不同。由于R1、R3的诱导率极低，故以R2、R4诱导培养基上接种的花药分析两个水稻品系的花药培养效率。如表5所示，无论是出愈率还是绿点率F2-19均比F2-17高，表明F2-19的花药培养效率高于F2-17。

表5　不同水稻基因型的花药培养效率对比

3　讨论

3.1培养基成分对花药培养效率的影响

水稻花药培养的培养基包括基本培养基、碳源、激素、琼脂以及其他成分等。经过大量的试验和比较，目前得到普遍适用于水稻花药培养的基础培养基有适合粳稻的N6［11］、籼稻的合5［12］，以及对粳籼稻均有较好效果的通用［13］和M8［14］等。各种基本培养基的主要差别在于比例不同。本研究所用的M8培养基的摩尔比为3.5∶28，低于N6的7∶28，与郭书巧等［14］分析的水稻籼粳交后代及其亲本的花药培养技术使用的基本培养基一致，2种基因型的水稻花药愈伤诱导率为5.56%～12.74%，诱导效果较好。

本研究设计了4种不同成分配比的诱导培养基，结果显示，混合碳源（麦芽糖+蔗糖）的诱导效果优于单一碳源（麦芽糖），这与朱永生等［15］提出混合使用蔗糖和麦芽糖对出愈率及培养力的改善效果更佳这一说法相符合。Tara D［16］指出水解酪蛋白等有机物的添加可以增加花药培养力，而谷氨酰胺、丙氨酸等有助于愈伤组织的形成。试验中培养基R4以麦芽糖作为单一碳源，添加一定含量的有机营养物（脯氨酸，谷氨酰胺及水解酪蛋白）后也显示出较好的诱导效果，说明外加氮源可以提高花药愈伤诱导率。

外源激素是促进愈伤组织诱导和分化的重要因素。许多试验证明，多激素配比使用比单一激素的诱导和分化效率高［14，17-18］，采用复合启动因子诱导愈伤组织可促进培养力低的材料的愈伤诱导和绿苗分化。本试验中诱导培养基使用2，4-D+KT+ NAA的混合激素，愈伤组织诱导率超过5%；分化培养基使用KT+6-BA+NAA的混合激素，能够促进较多的绿点产生，说明混合激素适用于粳粳交后代花药培养体系。

活性炭具有良好的吸附能力，至今已大量用于林木、禾谷类、蔬菜及其他经济作物的植物组织培养。有研究表明，加入适量的活性炭，能够吸附离体培养中的抑制物并降低玻璃苗的产生频率，但同时也会吸收培养基中的营养物质［19］。本试验中前3种诱导培养基均加入0.15%的活性炭，但仅R2有愈伤组织长出；相对应的未加活性炭的R4愈伤组织诱导效率显著提高，说明活性炭在本试验愈伤组织的诱导过程中不是必须的，且在添加有机营养物的条件下不需加入活性炭。综合来看，适宜本试验中的2种粳粳交后代的花药愈伤组织诱导培养基是M8+6%麦芽糖+2，4-D+KT+NAA+脯氨酸+谷氨酰胺+水解酪蛋白。今后试验中可以尝试同时使用混合碳源+有机营养物的诱导方法。

3.2愈伤组织褐化影响绿苗得率

褐化现象是指在外植体诱导初分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象［20］。本试验中愈伤组织转移至分化培养基后约10 d开始有绿点产生。随着时间推移，愈伤组织开始褐化（培养基并未变褐色）且褐化程度愈发严重，最终导致包括绿点在内的愈伤组织均褐化死亡，没有分化出幼苗。显然愈伤组织的褐化是没有分化出幼苗的重要原因，如何降低愈伤组织的褐化程度是解决低出苗率的关键。

引起褐化现象的因素很多，包括材料选择、培养基成分和形态、光温培养条件等［21］。试验中2 000 1x、12 h·d-1的光照条件以及（26±1）℃的温度设置可能不适宜绿苗的分化，需要考虑进一步减少光照并适当降低温度。尽管有报道显示，添加氨基酸能够提高绿苗分化率并减少愈伤组织的褐化［14，22］，但本试验中的有机营养物的添加并未促进绿苗的分化。黄翠红等［23］在研究水稻籼型恢复系花药培养时提出，诱导培养基中有机物的添加虽然有利于愈伤组织的诱导，但同时对愈伤组织的后续分化存在一定程度的负效应。另外，添加活性炭能降低培养基的透光率，提高愈伤组织的分化率［22］。综合来看，今后试验中可将有机营养物、活性炭作为分化培养基的变量进行分析。

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（责任编辑：张瑞麟）

S511

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0528-9017（2016）07-1045-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20160727

2016-03-08

台州市农业类一般项目（15ny04）；台州市院地合作项目（TYD-001-2）；浙江省9410计划资助项目

段 敏（1986—），女，安徽合肥人，农艺师，博士，主要从事水稻抗逆分子育种及组织培养工作，E-mai1：biyutianshi929 @sina.com。

潘晓飚（1966—），男，高级农艺师，E-mai1：tzxbpan@163.com。