福州地区大黄鱼变形假单胞菌的分离与鉴定

刘年锋，郭　睿，江小斌，张善霹，王　伟，郑晨晖，杨小强

(福州市海洋与渔业技术中心，福建 福州 350026)



福州地区大黄鱼变形假单胞菌的分离与鉴定

刘年锋，郭睿，江小斌，张善霹*，王伟，郑晨晖，杨小强

(福州市海洋与渔业技术中心，福建 福州 350026)

为研究2013年春夏之际罗源湾海区网箱养殖大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)内脏出现白点症状的病原，从具有临床症状的大黄鱼内脏中分离到优势菌，经回接感染试验证实该菌为病原菌；分析该病原菌的形态特征、理化特性、分类地位及药物敏感性等特性，结合16SrDNA序列构建的进化树与假单胞菌属恶臭群中的变形假单胞菌同源性最高，在99%以上，并通过看家基因gyrB序列分析进一步验证该菌为变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)；该菌对强力霉素、诺氟沙星、恩诺沙星3种抗生素敏感，对奥氟沙星、左氟沙星、四环素3种抗生素中度敏感。

大黄鱼；变形假单胞菌；16SrDNA；gyrB

大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)是我国海水网箱养殖的主要经济品种之一。福建省是大黄鱼的主要养殖区，养殖大黄鱼数量超过全国总产量的90%。近年来，随着养殖规模的扩大，大黄鱼不断发生各种疾病，如大黄鱼刺激隐核虫[1]，甚至出现大量死亡的现象，给养殖户造成较大损失。

2013年春夏之交，福建省罗源湾海区网箱养殖大黄鱼出现大面积内脏白点症状，并发生死亡。病鱼主要症状为离群、活力下降，体表及鳃无明显异常，解剖可见脾脏呈暗红色且有许多白色点状结节，直径约1 mm，病情严重的大黄鱼肝、肾组织内也有白色点状结节。本文对该病大黄鱼进行了病原分离、鉴定，并就病原菌的药物敏感性进行了试验，旨在为该病的病原研究和有效防治提供参考。

1　材料与方法

1.1试验鱼样品

11尾患病大黄鱼及9尾健康鱼，平均体长16 cm，于2013年2—5月采自罗源湾海区养殖网箱。回接感染试验用健康大黄鱼，平均体重(50±5)g，于2015年4月取自罗源湾某养殖鱼排。

1.2病原菌分离

取典型症状的患病大黄鱼鳃及体表黏液在显微镜下进行寄生虫和真菌排查。同时，无菌操作分别从11尾患病大黄鱼肝脏、肾脏、脾脏组织划线分离于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板，于24℃恒温培养24 h，并以9尾健康大黄鱼肝脏、肾脏、脾脏组织作细菌分离对照。纯化菌株于胰蛋白胨大豆肉汤24℃培养16 h后，分装并加20%甘油在-80℃保存备用。

1.3回接感染试验

将已纯化菌株接种于TSA平板，25℃培养16 h后，用无菌超纯水洗脱制备菌悬液，分别制成浓度1.0×105、1.0×104、1.0×103cfu/mL的菌悬液备用。试验设3个试验组和一个对照组，每组设立2个平行，每平行试验桶盛人工海水300 L和室内暂养一周后的健康大黄鱼15尾。采用腹腔注射相应浓度的菌悬液进行感染，对照组注射无菌超纯水，注射剂量均为0.2 mL。水温控制在(20±1)℃，期间充氧、不投饵、日常清污、补水，自注射后连续7日观察、记录各组的死亡数量，并对死鱼进行解剖和病原菌的再分离鉴定。

1.4病原菌形态观察和生理生化鉴定

取纯培养菌株接种于TSA平板上，24℃培养16～24 h，观察菌落大小和形态，并进行革兰氏染色和鞭毛染色，在光学显微镜下观察细菌形态特征。采用API 20NE细菌鉴定试剂条和传统方法测定病原菌的理化特征[2]，参照伯杰氏细菌鉴定手册进行分类[3]。

1.516SrDNA序列测定与系统发育树分析

用百泰克细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)制备得模板DNA。应用16SrDNA通用引物，正向27F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反应体系(50 μL)：2×PCR mix 24 μL，10 μmol/L的引物各1 μL，模板DNA 1 μL，超纯水23 μL。PCR反应条件：95℃、2 min；95℃、35 s，50℃、35 s，72℃、90 s，30个循环；72℃、5 min。PCR产物经ABI 3730 DNA 测序仪双向测序后，用DNAMAN 5.1对测序结果进行人工校正。

将分离菌的16SrDNA序列与GenBank中的已报道核酸序列进行在线Blast分析，下载与该序列同源性较高的核酸序列，并参照LPSN(http：//www.bacterio.cict.fr/)获得相关模式菌株的16SrDNA基因序列。

将上述序列使用Mega 4.0完成序列比对后，采用临接法(NJ)(设定bootstrap replications=1 000)构建系统发育树。

1.6gyrB基因测定与系统发育树分析

以上述菌株DNA为模板，进行PCR扩增检测，运用Yamamoto等报道的引物[4]，正向为F：5’-CAGGAAACAGCTATGACCAYGSNGGNGGNA ARTTYR A-3’，反向R：5’-TGTAAAACGACGGC CAGTGCNGGRTCYTTYTCYTGRCA-3’。除退火温度为60℃外，PCR反应体系及反应条件及构建系统发育树方法同1.5。

1.7药敏试验

用杭州天和微生物试剂有限公司生产的药敏纸片，按常规纸片法进行药敏试验[5]。

2　结果与分析

2.1病鱼检查结果

病鱼养殖海区水温为16～24℃，病鱼主要症状为离群、活力下降，体表及鳃无异常，解剖可见11尾大黄鱼脾脏呈暗红色且均有许多白色点状结节内生，直径约小于1 mm，病情严重的大黄鱼的肝、肾组织内也有白色点状结节。而9尾健康大黄鱼无前述症状。将20尾鱼通过水浸片观察，均未检出寄生虫和真菌。

2.2分离菌株形态特征

从病鱼的的肝脏、肾脏、脾脏分离得到形态、大小、颜色在TSA平板上均一致的优势菌24株，编码为：dhy201301，dhy201302，……，dhy2013024，菌落特征为：圆形、边缘齐整、表面光滑、湿润、呈米黄色，直径1～2 mm。而9尾健康大黄鱼相应组织未分离得到细菌。

2.3回接感染试验结果

dhy201308菌对健康大黄鱼均有致病性，从注射第五日起出现死亡，且死亡个体的脾脏、肾脏出现明显的白色结节症状，少数个体肝脏也有出现白色结节症状，这与自然发病情况完全相同。此外，从感染发病个体重新分离得到的菌株，其形态与生理生化特征和dhy201308菌株完全一致。由此可见，分离菌株是该病的直接病原。回接感染结果见表1，观察期为7 d，分离菌经腹腔注射感染的毒力很强，1.0×105组7 d内100%死亡。

表1　分离菌株dhy201308的回接感染试验

2.4分离菌株的生理生化特征

dhy201301～24革兰氏染色呈阴性，杆状，端生鞭毛。采用API 20NE系统鉴定编码为1150567(6株)、1050567(18株)，前者与变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)模式种FPC 951的对应指标[6-7]完全一致，后者与前者仅差精氨酸双水解酶一个指标。分离细菌的常规生理生化特性主要为氧化酶阳性，硝酸盐还原阳性，利用葡萄糖、癸酸、苹果酸、柠檬酸、苯乙酸，不产硫化氢，不产吲哚，明胶液化阴性，如表2。

表2　分离菌株的生理生化特性

注：“+”为阳性；“-”为阴性；“D”为菌株间差异。

Notes：+ indicated positive，-indicated negative，D indicated difference among strains.

2.516SrDNA序列分析及系统发育树构建

获得24株菌的16SrDNA序列24条，长度约1 500 bp。将24条序列分别输入GenBank数据库中进行Blast比对，结果均显示与假单胞菌属中的变形假单胞菌(P.plecoglossicida)、恶臭假单胞菌(P.putida)、蒙氏假单胞菌(P.monteilii)同源率达99%。从比对结果列表中提取假单胞菌属模式种及其他相关菌株的16SrDNA序列，以鮰爱德华菌(Edwardsiellaictaluri)为外群，构建菌株dhy201308的系统发育树。在16SrDNA系统发育树中，菌株dhy201308(GenBank登录号为KF934316)与假单胞菌属恶臭群聚为一簇，而与变形假单胞菌(P.plecoglossicida)模式种(FPC 951=ATCC 700383=CCUG 49623=CIP 106493=DSM 15088=JCM 21584=NBRC 103162，GenBank数据库登录号为AB009457.1)自然聚为一枝，表明它们亲缘关系最近，将其初步鉴定为变形假单胞菌，如图1。

图1基于16S rDNA 序列构建的菌株dhy201308 的系统发育树

Fig.1Phylogenetic tree of strain dhy201308 based on 16S rDNA sequences

2.6gyrB基因序列分析与系统发育树构建

获得24株菌的gyrB基因序列24条，长度约900 bp。将24条序列分别在GenBank数据库中进行Blast比对，结果显示24株菌的gyrB基因序列仅与变形假单胞菌同源率达99%。由此将24株菌鉴定为变形假单胞菌。在构建的gyrB基因序列系统发育树中，菌株dhy201308(GenBank登录号为KF934317)与变形假单胞菌标准株自然聚为一枝，如图2。

图2基于gyrB 基因序列构建的菌株dhy201308 的系统发育树

Fig.2Phylogenetic tree of strain dhy201308 based on gyrB sequences

2.7分离菌株的药敏

体外抑菌试验的结果显示，全部24菌株对强力霉素、诺氟沙星、恩诺沙星3种抗生素敏感；对奥氟沙星、左氟沙星、四环素3种抗生素中度敏感；对氟苯尼考等12种抗生素不敏感，如表3。

表3　分离菌株dhy201308的药敏试验结果

续表3

注：1.抑菌圈直径包括药敏纸片直径7 mm；2.R(耐药)：7 mm≤抑菌圈直径≤14 mm；S(敏感)：抑菌圈直径≥20 mm；I(中介)：15 mm≤抑菌圈≤19 mm。

Note：1.The inhibition zone include 7 mm of slips diameter，2.R(resistance)was 7 mm≤inhibition zone≤14 mm，S(sensitive)was inhibition zone≥20 mm，I(intermediate)was 15 mm≤inhibition zone≤19 mm.

3　讨论

3.1大黄鱼内脏白点症病原

大黄鱼内脏白点症一直是水产业界关注的问题之一，许多学者对其病原进行了分离研究。刘家富等认为宁德地区大黄鱼的内脏白点症是由门多萨假单胞菌(P.mendocina)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)引起的[8]，沈锦玉等从浙江省宁波、台州的发病大黄鱼中分离得病原，研究认为恶臭假单胞菌(P.putida)是该病的病原[9]，邱杨玉等研究认为浙江省宁波市象山港患病大黄鱼的病原为恶臭假单胞菌(P.putida)[10]，但毛芝娟等对该菌的进一步研究，将其鉴定为变形假单胞菌(P.plecoglossicida)，并通报了该菌的基因组草图[11]。本文从患内脏白点症的大黄鱼内脏分离到24株菌，均为变形假单胞菌(P.plecoglossicida)，从同浓度细菌腹腔注射的试验结果比较，其致病性强于邱杨玉等研究的菌株。

3.2变形假单胞菌的鉴定

变形假单胞菌(P.plecoglossicida)是由Nishimori等从香鱼出血性腹水病中分离并定种[7]，并被原核生物系统命名名录(LPSN)收入。基于假单胞菌属的16SrDNA序列进化树，其在伯杰氏手册中被归为恶臭假单胞菌群[3]。郭亚辉等认为目前假单胞菌属分类比较混乱，其系统发育关系有进一步修正的可能[12]。由于同一种属细菌内的不同菌株之间的生理生化试验结果往往存在一定的差异，特别是模式种，因而从表型鉴定菌种易产生错误。16SrDNA系统发育树分析从序列同源性的角度实现对细菌的分类学鉴定，但方法受细菌16SrDNA序列库数据不完备的制约。故对细菌种类鉴定时宜用多元方法，如表型测定、16SrDNA分子鉴定、看家基因鉴定等，才能保证鉴定结果的可靠性。

本文所述24株菌，在16SrDNA序列比对过程中，剔除非模式菌株的干扰，初步鉴定为变形假单胞菌(P.plecoglossicida)，并通过生理生化、细菌形态等表型研究加以验证。为进一步确定鉴定结果的可靠性，选择对其看家基因gyrB进行分子鉴定，通过序列同源性及系统发育树分析，确定分离菌株为变形假单胞菌(P.plecoglossicida)。在该菌分子鉴定中，使用gyrB看家基因进行鉴定比16SrDNA分子鉴定更加准确。

3.3大黄鱼内脏白点症的防治

假单胞菌广泛存在于自然水体中，易存活在天然冰鲜饵料中。由于冰鲜饵料的加工过程是一个制备鱼糜的过程，这就给假单胞菌提供了扩散、活化、增殖的条件。这些混入饵料的假单胞菌，经口摄入大黄鱼体内有可能造成大黄鱼感染发病。针对该病的流行特点，在养殖过程，建议尽可能减少冰鲜饵料的投喂，改用人工配合饲料，并在实际生产中，及时检查鱼病发生情况，一旦发现该病，可参考使用强力霉素、诺氟沙星、恩诺沙星3种抗生素对大黄鱼内脏白点症的防治，同时对病死鱼及时处理，避免交叉感染。

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Isolation and identification of Pseudomonas plecoglossicida in large yellow croaker(Pseudosciaena crocea)of Fuzhou area

LIU Nianfeng，GUO Rui，JIANG Xiaobin，ZHANG Shanpi*，WANG Wei，ZHENG Chenhui，YANG Xiaoqiang

(Fuzhou Ocean and Fisheries Technology Center，Fuzhou 350026，China)

The cultured large yellow croakers(Pseudosciaenacrocea)of Luoyuan Bay got white nodules disease at the end of spring and the beginning of summer in 2013.The pathogen was isolated from spleen，liver and kidney with significant pathological signs of fishes，then its morphological，physiological and biochemical characteristics，taxonomic status，and drug sensitivity were analyzed.The 16SrDNA sequences of the pathogen was more than 99% homology withPseudomonasplecoglossicidainP.putidagroup，the analysis of housekeeping genegyrBconfirmed its phylogenetic affiliation and showed identities more than 99% homology，which was also demonstrated by biochemical tests.The test result of the sensitivity to antibiotics showed that doxycycline，norfloxacin and enrofloxacin had the most inhibitive effects on the strains，while ofloxacins，levofloxacin and tetracycline had intermediate sensitive.

large yellow croaker(Pseudosciaenacrocea)；Pseudomonasplecoglossicida；16SrDNA；gyrB

2015-12-21

农业部2013年国家水生动物疫情监测计划——福建省刺激隐核虫病监测；福州市海洋与渔业局2013年水产养殖病害监测专项.

刘年锋(1979-)，男，高级工程师，主要从事水生生物病害研究与技术推广.E-mail：36099272@qq.com

张善霹(1969-)，男，高级工程师，主要从事水产养殖技术研究.E-mail：309468990@qq.com

S941

A

1006-5601(2016)01-0014-07

刘年锋，郭睿，江小斌，等.福州地区大黄鱼变形假单胞菌的分离与鉴定[J].渔业研究，2016，38(1)：14-20.