Nesfatin-1调控斜带石斑鱼生殖作用的研究

王　庆,刘琼瑜，李益祺，刘雅莉，李　玉，陈嘉兴，张海发，李水生，张　勇，，林浩然，3*

(1.中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广东 广州 510275；2.广东省海洋渔业实验中心，广东 惠州 516081；3.海南大学海洋学院，海南 海口 570228)



Nesfatin-1调控斜带石斑鱼生殖作用的研究

王庆1,刘琼瑜1，李益祺1，刘雅莉1，李玉1，陈嘉兴1，张海发2，李水生1，张勇1，2，林浩然1，3*

(1.中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广东 广州 510275；2.广东省海洋渔业实验中心，广东 惠州 516081；3.海南大学海洋学院，海南 海口 570228)

Nesfatin-1是核连蛋白-2(nucleobindin-2，NUCB2)裂解后产生的一种神经肽。本研究克隆得到斜带石斑鱼两种编码NUCB2(NUCB2a和NUCB2b)基因的cDNA序列(nesfatin-1a和nesfatin-1b)，并对它们的表达模式进行了研究。结果表明nesfatin-1a和nesfatin-1b在脑组织中广泛表达。在下丘脑中，两种nesfatin-1在卵巢发育的Ⅰ-Ⅴ时期表达量都比较低，在Ⅵ时期卵巢(退化的卵黄生成阶段的卵母细胞)中的表达量显著升高，揭示nesfatin-1可能参与了卵巢成熟的调控。进一步采用腹腔注射实验研究了两种nesfatin-1对生殖轴的影响。注射nesfatin-1a和nesfatin-1b 15 min和60 min后，下丘脑中促性腺激素释放激素Ⅰ型(GnRH-Ⅰ)和促性腺激素释放激素Ⅲ型(GnRH-Ⅲ)的表达量都显著下降；此外，垂体中FSH-β的表达在注射nesfatin-1 60 min后显著下调。这些结果表明nesfatin-1a和nesfatin-1b参与了斜带石斑鱼下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)的调控。

斜带石斑鱼； nesfatin-1；组织分布；生殖调控

Nesfatin-1(NEFA/NUCB2 encoded satiety and fat-influencing protein)是由核连蛋白-2(nucleobindin-2，NUCB2)裂解后产生的一种含82个氨基酸的厌食肽[1]。在人类和小鼠中研究发现，前体肽NUCB2由24个氨基酸的信号肽和396个氨基酸的蛋白组成[2-3]。NUCB2经激素原转化酶剪切成nesfatin-1(1-82)、nesfatin-2(85-163)、nesfatin-3(166-396)三个片段，其中nesfatin-1本身又可以分为3个片段，第23～53氨基酸片段称为M30，是nesfatin-1发挥作用的关键片段[4]。Nesfatin-1在中枢神经系统如弓状核(arcuate nucleus，ARC)、下丘脑外侧区(lateral hypothalamic area，LHA)、室旁核(virtual private network，PVN)、视上核(supraoptic nuclei，SON)及外周组织如心肌、胃、胰腺、肝、小肠、睾丸等表达[5-11]，提示该神经肽具有广泛的生理作用。

随着对nesfatin-1研究的深入，发现nesfatin-1在摄食调控、能量代谢[12]、胰岛素调节[13]、血压调节[14]、脂肪细胞调控[8]等多方面发挥作用。而且，nesfatin-1在鼠的睾丸及卵巢中有表达[7]，提示nesfatin-1可能参与生殖调控。Nesfatin-1编码基因已经在金鱼[3]、斑马鱼[15]、齐口裂腹鱼[16]等鱼中克隆得到。在金鱼中的研究发现，腹腔注射nesfatin-1抑制GnRH和GtH的mRNA表达，揭示其参与了生殖调控[17]。斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)是我国南方重要的海水鱼类，是一种雌雄同体先雌后雄的鱼，生殖发育具有其明显的调控特点。

在本研究中，我们在斜带石斑鱼中克隆得到两种NUCB2基因并获得了两种nesfatin-1的氨基酸序列。组织表达模式研究表明两种nesfatin-1均在脑和性腺中表达。进一步研究发现nesfatin-1在卵巢退化期表达量最高，腹腔注射nesfatin-1显著下调GnRH-Ⅰ、GnRH-Ⅲ和FSH-β的表达，表明nesfatin-1对斜带石斑鱼下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)具有调控作用。

1　材料与方法

1.1样品采集

1.1.1克隆和组织分布的样品采集

本实验所用斜带石斑鱼来自广东省海洋渔业实验中心，体重在700～750 g之间的鱼，采用循环过滤海水在25～30℃条件下养殖。取样前，对鱼进行麻醉处理，取不同分区的脑组织和外周组织，放入液氮中进行速冻处理，然后保存在-80℃超低温冰箱备用。取样时所用的剪刀、镊子等均经过180℃烘烤4 h以上，存放样品的1.5 mL离心管采用不含有RNA酶的进口离心管。所有的动物实验均按照中山大学动物研究伦理委员会对进行动物实验时所做的规章制度进行操作。

1.1.2卵巢不同发育时期样品采集

不同时期斜带石斑鱼样本均取自广东省海洋渔业实验中心，采用车间循环水养殖。卵巢发育根据成熟程度划分为6期，每个发育时期的鱼都选取5条，取下丘脑于冻存管(无RNA酶)中，放入液氮中速冻再转入-80℃超低温冰箱备用。性腺样本用石蜡包埋后切片，在光学显微镜下判断性腺发育时期。

1.1.3腹腔注射实验的样品采集

腹腔注射实验所用斜带石斑鱼来自广东省海洋渔业实验中心，60条体重600～700 g、体长30～35 cm的鱼。饲养在室内海水池中并驯化两周后开始实验。将实验用鱼分成三组，每组20条，分别注射生理盐水、nesfatin-1a、nesfatin-1b，注射剂量为50 ng/g体重，注射15 min后，各组随机取10条鱼，取样下丘脑和垂体，其余10条个体60 min后取样下丘脑和垂体。

1.2方法和处理

1.2.1引物设计

根据GenBank上的NUCB2序列和已有斜带石斑鱼的转录组数据比对分析，找出两种斜带石斑鱼NUCB2的序列并命名为NUCB2a和NUCB2b。利用软件primer premier 5.0设计斜带石斑鱼NUCB2克隆和RT-PCR的特异性引物。具体引物序列如表1所示。

1.2.2RNA提取及cDNA模版的制备

总RNA的提取采用Trizol reagent说明书及操作步骤来进行，再反转录成cDNA模板，用于基因克隆(polymerase chain reaction，PCR)和实时定量PCR(real time-polymerase chain reaction，RT-PCR)。

1.2.3NUCB2基因的克隆与分析

用反转录出来的cDNA为模板，以NUCB2a和NUCB2b的简并引物(NUCB2-F和NUCB2-R)进行聚合酶链式反应来克隆NUCB2a和NUCB2b的全长序列。琼脂糖凝胶电泳验证后将目的条带回收，用E.Z.N.A Plasmid Extraction Kit(Omega Bio-Tek公司，USA)对回收产物进行纯化，然后对回收产物进行连接转化和菌液验证，将验证后的菌液送至广州英骏公司进行测序。测序结果出来后，NUCB2的氨基酸序列利用BioEdit软件翻译，NUCB2蛋白序列的多重比对和进化树分析使用Clustal W1.83和MEGA 5.0软件进行，并通过网站SignalP 4.1 server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)预测NUCB2的信号肽。

1.2.4实时定量PCR及数据分析

采用上述方法提取样品总RNA，然后反转录成cDNA。以cDNA为RT-PCR模板，同时提取标准质粒DNA制备标准曲线用于RT-PCR，选取β-actin 作为内参基因。选用SYBR Green Realtime PCR Master Mix plus kit(TOYOBO公司，Japan)试剂盒进行RT-PCR试验。反应程序为：先95℃预变性4 min；接着95℃变性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸20 s，共40个循环;最后在84℃收集荧光。分析溶解曲线，确定RT-PCR的质量，用Excel表格初步处理数据，再利用Graphpad Prism5.0软件对数据进行处理和分析。

表1　PCR及qt-PCR引物的设计

2　结果与分析

2.1斜带石斑鱼nesfatin-1氨基酸比对及与其它脊椎动物相似性分析

本研究中，我们克隆得到两种NUCB2基因(分别命名为NUCB2a和NUBC2b)，编码两种nesfatin-1肽段(nesfatin-1a和nesfatin-1b)，分别为115个氨基酸(aa)和106个氨基酸(aa)(图1a)。在NUCB2a和NUCB2b的nesfatin-1区域氨基酸序列的N-末端是31aa和23aa的信号肽，30aa(M30)的核心肽序列以及两个由赖氨酸和精氨酸残基构成的蛋白水解酶切割位点(Lys114-Arg115和Lys105-Arg106)(图1a)。

不同物种nesfatin-1的氨基酸序列对比显示，斜带石斑鱼nesfatin-1a氨基酸序列与三刺鱼nesfatin-1a的相似性最高(92%)，与其它鱼类如红鳍东方鲀、斑马鱼、金鱼等相似性在80%以上，而与哺乳类的相似性较低(57%～64%)。nesfatin-1b氨基酸序列同样与三刺鱼nesfatin-1b的相似性最高(90%)，与斑马鱼、金鱼相似性在70%以上，而与哺乳类如牛、鼠、人的相似性只有50%左右如图1b所示。

图2所示，斜带石斑鱼与某些典型的哺乳类、爬行类、两栖类、鱼类NUCB2的nesfatin-1区域氨基酸序列所构建的系统进化树分析表明，斜带石斑鱼的nesfatin-1a聚集在硬骨鱼类的分支上。斜带石斑鱼nesfatin-1a与三刺鱼的nesfatin-1a的关系最近，与斑马鱼的的关系次之，而与哺乳类的关系较远。鱼类nesfatin-1b聚集成一个分支，与鱼类nesfatin-1a及哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类的nesfatin-1分开。斜带石斑鱼的nesfatin-1b与三刺鱼的nesfatin-1b的关系最近而与哺乳类和鸟类关系较远。

图1 a.斜带石斑鱼NUCB2a 和NUCB2b 的nesfatin-1 区域氨基酸序列比对，b.典型脊椎动物NUCB2 蛋白质nesfatin-1 区域氨基酸序列比对

Fig.1 Alignment of the nesfatin-1 region amino acid sequence of NUCB2 protein sequences a：NUCB2a andNUCB2b of E.coioides，b：Alignment of E.coioides nesfatin-1 region amino acid sequence of NUCB2 proteinsequences with other species

注：实线方框表示M30序列； 虚线方框表示蛋白质水解酶切割位点；底下画虚线表示信号肽；有颜色的表示物种之间的保守区域；物种名字和这些物种的GenBank(www.ncbi.nim.nih.gov) 登记号码或者 Ensembl(www.ensembl.org)身份号码如下：斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides) NUCB2a和NUCB2b；金鱼Carassiusauratus(NUCB2：GenBank：ADK94363.1)，斑马鱼Daniorerio(NUCB2A：NCBI No. NP_958901.1 and NUCB2B：NCBI No. NP_958887.1)，青鳉Oryziaslatipes(NUCB2A：NCBI No. XP_004067067.1 and NUCB2B GenBank No. ENSORLP00000001612)，红鳍东方鲀Takifugurubripes(NUCB2A：GenBank No.ENSTRUP00000044315)，青斑河豚Tetraodonnigroviridis(NUCB2A，ENSTNIP00000012254)，三刺鱼Gasterosteusaculeatus( ENSGACP00000016912；NUCB2A，ENSGACP00000020611 and NUCB2B，ENSGACP00000008999)，非洲蟾蜍Xenopustropicalis(NUCB2：NCBI No. NP_001015824.1)，鸡Gallusgallus(NUCB2：NCBI No. NP_001006468.1)，牛Bostaurus(NUCB2：NCBI No. NP_001068849.1)，鼠Musmusculus(NUCB2：NCBI No. NP_001123951.1)，人Homosapiens(NUCB2：NCBI No. NP_005004.1).

图2斜带石斑鱼NUCB2a 和NUCB2b nesfatin-1 区域与其它物种的进化树分析

Fig.2Phylogenetic tree illustrating the relationship between E.coioides NUCB2a and NUCB2b with those ofother species NUCB2

注：用于进化树分析的物种名称和基因库的登记号码如下：斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides) NUCB2a和NUCB2b；金鱼Carassiusauratus(NUCB2：GenBank：ADK94363.1)，斑马鱼Daniorerio(NUCB2A：NCBI No.NP_958901.1 and NUCB2B：NCBI No. NP_958887.1)，青鳉Oryziaslatipes(NUCB2A：NCBI No. XP_004067067.1 and NUCB2B GenBank No. ENSORLP00000001612)，红鳍东方鲀Takifugurubripes(NUCB2A：GenBank No.ENSTRUP00000044315)，青斑河豚Tetraodonnigroviridis(NUCB2A，ENSTNIP00000012254)，三刺鱼Gasterosteusaculeatus( ENSGACP00000016912 and NUCB2A，ENSGACP00000020611；NUCB2B，ENSGACP00000008999)，非洲蟾蜍Xenopustropicalis(NUCB2：NCBI No. NP_001015824.1)，鸡Gallusgallus(NUCB2：NCBI No. NP_001006468.1)，牛Bostaurus(NUCB2：NCBI No. NP_001068849.1)，鼠Musmusculus(NUCB2：NCBI No. NP_001123951.1)，人Homosapiens(NUCB2：NCBI No. NP_005004.1).

2.2nesfatin-1在斜带石斑鱼中的组织分布表达模式

通过实时荧光定量PCR技术检测了nesfatin-1a和nesfatin-1b在斜带石斑鱼不同组织中mRNA的表达水平，结果如图3所示。 Nesfatin-1a和nesfatin-1b都在脑组织中有广泛的表达。同时在外周组织也有一定的表达，如nesfatin-1a在外周组织脾脏中的表达量高而在肠、鳃、心中的表达量较低，nesfatin-1b则是在肝脏中表达量较高，但是在脾脏、肠、鳃等组织表达量极低。

图3斜带石斑鱼nesfatin-1a 和nesfatin-1b 在不同组织中的表达模式

Fig.3Tissue distribution of nesfatin-1a and nesfatin-1b of E. coioides

注：所有数值用平均值±标准差(mean±SEM)来表示。

2.3Nesfatin-1在卵巢不同发育时期的表达

在下丘脑中，nesfatin-1a在卵巢发育的Ⅰ-Ⅴ 时期表达量都比较低，在下丘脑中，nesfatin-1a在卵巢发育的Ⅰ- Ⅴ 时期表达量都比较低，且Ⅰ、Ⅲ 时期的表达量要高于Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ 时期，但在Ⅵ 时期显著升高。 同样，nesfatin-1b的表达量在Ⅰ-Ⅴ 时期比较低且呈现缓慢下降的趋势，到第Ⅵ 时期表达量显著升高(图4)。

图4斜带石斑鱼nesfatin-1a 和nesfatin-1b 在卵巢发育不同时期的相对表达水平

Fig.4Levels of mRNA expression for nesfatin-1a and nesfatin-1b during ovary development in E.coioides

注：所有数值用平均值±标准差(mean±SEM)来表示。

2.4腹腔注射试验中nesfatin-1对GnRH和GtH表达模式

如图5所示，注射nesfatin-1a 15 min和60 min后下丘脑GnRH-Ⅰ和GnRH-Ⅲ的表达显著性下降；同样注射nesfatin-1b在15 min和60 min后显著抑制下丘脑GnRH-Ⅰ和GnRH-Ⅲ的表达。注射nesfatin-1a 15 min后对垂体LH-β及FSH-β的表达没有影响，60 min后显著地抑制了FSH-β的表达；注射nesfatin-1b 15 min后对垂体LH-β及FSH-β的表达没有影响，注射60 min后显著抑制了FSH-β的表达。

图5腹腔注射试验中斜带石斑鱼GnRH 和GtH 的表达模式

Fig.5Expression pattern of the E. coioides GnRH and GtH in intraperitoneal injection test

注：Control：对照组；nesfatin-1a：注射nesfatin-1a多肽组；nesfatin-1b：注射nesfatin-1b多肽组。GnRH和GtH mRNA相对表达水平用平均值±标准差(mean±SEM)表示(n=10)；*表示与对照组差异显著(P<0.05)。

3　讨论

根据GenBank数据库和实验室研究组已有的斜带石斑鱼转录组数据的比对分析结果可知，在斜带石斑鱼中克隆得到两种NUCB2基因序列NUCB2a和NUCB2b。它们产生的nesfatin-1(nesfatin-1a和nesfatin-1b)的氨基酸序列与鱼类、鸟类、爬行类、哺乳类的成熟肽结构相似。进化树分析结果表明斜带石斑鱼的NUCB2a与鱼类的NUCB2a聚集在一起，而NUCB2b聚集在一支，其他的脊椎动物聚集在一支。相似性分析表明，斜带石斑鱼nesfatin-1a和nesfatin-1b均与其它鱼类nesfatin-1的相似性较高，与哺乳类的相似性则比较低。前人对nesfatin-1三个潜在的片段(N-末端的N23区，C-末端的C29区和中心的M30区)分析发现中间的M30区域是nesfatin-1的主要功能区域[18]。通过比较斜带石斑鱼nesfatin-1a和nesfatin-1b的M30区域发现这个区域的氨基酸高度保守。此外，斜带石斑鱼nesfatin-1a和nesfatin-1b都有由两个潜在的赖氨酸和精氨酸残基构成的蛋白水解酶切割位点(Lys114-Arg115和Lys105-Arg106)，表明在斜带石斑鱼中M30肽段是主要的活性功能区域。

通过组织分布结果发现nesfatin-1a在脑、脾脏、胃、肌肉中表达比较丰富，而nesfatin-1b在脑、肝脏、肌肉中表达量比较多，且nesfatin-1a和nesfatin-1b在斜带石斑鱼脑组织和性腺中都有表达，这与金鱼和齐口裂腹鱼的组织分布相似[2][16]。Nesfatin-1a和nesfatin-1b在不同组织中的广泛分布表明它们可能存在多方面的功能。在脑组织和性腺中的大量表达说明nesfatin-1可能参与生殖调控。此外，nesfatin-1a在脾脏中表达量高，这可能与斜带石斑鱼的血压调节和免疫有关，哺乳动物中也有过相关的研究报道[14][19]。而nesfatin-1b在垂体和肝脏中的表达量很高，垂体是鱼类生殖轴的重要组成部分[20]，而肝脏是调节摄食和能量代谢的重要器官，这说明nesfatin-1b可能对卵巢发育和能量代谢起到了调控作用。研究结果发现两种nesfatin-1在脑组织中的表达量均丰富，这说明nesfatin-1是个重要的神经内分泌因子。

在小鼠中的研究表明在雌鼠的青春期下丘脑中NUCB2/nesfatin-1的mRNA和蛋白水平显著升高，脑腔注射nesfatin-1 15 min后会导致垂体LH-β水平下降[7]；在金鱼中，nesfatin-1参与了金鱼下丘脑-垂体-卵巢生殖轴的调控[21]。本研究发现，斜带石斑鱼腹腔注射nesfatin-1a和nesfatin-1b显著下调GnRH-Ⅰ、GnRH-Ⅲ和FSH的表达。通过在卵巢不同发育时期对下丘脑中两种nesfatin-1的表达量分析表明，两种nesfatin-1都是在卵母细胞退化时期表达量很高，而斜带石斑鱼在卵母细胞退化阶段FSH和LH的表达量显著下降[22]。因此，nesfatin-1的大量表达可能对生殖轴产生抑制作用，从而导致卵母细胞退化。

4　结论

综上所述，斜带石斑鱼nesfatin-1a和nesfatin-1b都参与了生殖轴的调控。nesfatin-1a和nesfatin-1b均抑制了下丘脑GnRH-Ⅰ、GnRH-Ⅲ和垂体FSH的表达，并且这种抑制作用是按照下丘脑-垂体-性腺轴从上往下进行。同时，在卵巢发育过程中，两种nesfatin-1都与卵母细胞的退化有关。

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The study of nesfatin-1 in Epinephelus coioides reproductive regulation

WANG Qing1，LIU Qiongyu1，LI Yiqi1，LIU Yali1，LI Yu1，CHEN Jiaxing1，ZHANG Haifa2，LI Shuisheng1，ZHANG Yong1，2，LIN Haoran1，3*

(1.Institute of Aquatic Economic Animals and Guangdong Provincial Key Laboratory for Aquatic Economic Animals，Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510275，China；2. Marine Fisheries Development Center of Guangdong Province，Huizhou 516081， China；3. College of Ocean，Hainan University， Haikou 570228，China)

Nesfatin-1 is the hypothalamus gene encoding nuclear protein-2(nucleobindin-2，NUCB2) produces a neuropeptide after cracking. Studies have shown that nesfatin-1 play an important role in reproductive regulation，in order to study the nesfatin-1 relation withEpinepheluscoioidesreproductive regulation，in this paper，we have cloned two NUCB2(NUCB2a and NUCB2b) gene，analyzes NUCB2 coding protein get sequence of amino acids about two nesfatin-1(nesfatin - 1a and nesfatin-1b)，at the same time，we analysis of the two kinds of nesfatin-1’s signal peptide and mature peptide，found it is consistent with that of vertebrates. Through real-time quantitative PCR technology，we determined the mRNA expression level ofEpinepheluscoioidesnesfatin-1 in different tissues. The expression patterns revealed that，nesfatin-1a and nesfatin-1b widely expressed in the brain tissue，especially nesfatin-1b abundantly expressed in the pituitary，also has the corresponding expression in the gonads. We determined thenesfatin-1 mRNA expression level of hypothalamus during ovary development，the result reveal that，nesfatin-1a and nesfatin-1b in the ovaries Ⅵ period(degradation of yolk formation stage oocytes) significantly increased，showed that two kinds of nesfatin-1 are likely to participate in the regulation of ovarian mature. The intraperitoneal injection experiment results show that，injecting nesfatin - 1a and nesfatin-1b 15 min，both GnRH1 and GnRH3 mRNA expression level of the hypothalamus are reduce，but in the pituitary LH-βand FSH -βmRNA expression level has not changed. Injection of nesfatin-1a and nesfatin-1b 60 min，the mRNA expression level of the hypothalamus GnRH1 and GnRH3 still suppressed. Injected nesfatin-1a and nesfatin-1b after 60 min，there have no effect change on the expression level of LH-β，but significantly reduced the expression of FSH -β. Through the above study shows nesfatin - 1a and nesfatin-1b involved inEpinepheluscoioidesreproductive regulation.

Epinepheluscoioides； nesfatin-1； tissue distribution； reproductive regulation

2016-01-15

国家自然科学基金面上项目，31572596；广州市科技计划珠江科技新星专项,2013J2200093号;广东省海洋渔业科技推广专项,A201400A01号, A201501A03号, A201501A09号.

王庆(1988-), 博士研究生, E-mail:heicaonan@163.com

林浩然, 中国工程院院士, 教授, E-mail:lsslhr@mail.sysu.edu.cn

Q74，S917

A

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