一例引起南日鲍死亡的病原分离与鉴定

严志洪

(莆田市秀屿区水产技术推广站，福建 莆田 351146)



一例引起南日鲍死亡的病原分离与鉴定

严志洪

(莆田市秀屿区水产技术推广站，福建 莆田 351146)

观察了一例南日鲍(Haliotis discusnanri)病鲍的症状，从病症明显的濒临死亡的南日鲍病鲍足部病灶区、消化腺中分离得到一株优势菌，并对该优势菌进行了浸浴感染和注射感染的回归感染试验、生理生化特征测定及药敏试验。结果表明：南日鲍发病初期，没有明显的症状，发病持续一段时间后足部表面有大小不一的溃烂孔；回归感染试验结果表明该优势菌为致病菌，经生化指标的测定，确定该致病菌为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)；该菌对氟甲喹和氟苯尼考等21种抗菌药物敏感。本研究结果为南日鲍病害防治提供一些基础数据。

南日鲍；溶藻弧菌；药敏试验

南日鲍( Haliotis discusnanri) 是以皱纹盘鲍(H.discushannai) 为母本、日本盘鲍(H.discusdiscus) 为父本杂交的后代，并在福建莆田南日岛海域养殖[1]。由于独特的自然环境条件，南日鲍具有体肥壳艳、煮后发胖的特色，因而深受广大消费者的喜爱。随着养殖规模的扩大及养殖密度的提高，南日鲍病害发生日趋严重。已有研究结果表明，病毒[2]、立克次体[3]、细菌[4]、真菌[5]、寄生虫[6]等均能使鲍发病。在鲍的弧菌病方面，已报道的病原菌有哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)[4]、溶藻弧菌(V.alginolyticus)[7]、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)[7]和河流弧菌(V.fluvialis)[8]等，但对于南日鲍病害研究未见专题报道，本文对南日鲍病鲍进行病症观察、病原菌分离、回归感染试验、病原菌生化测定及药敏试验，其研究结果可为南日鲍病害防治提供一些基础数据。

1　材料与方法

1.1材料

南日鲍病鲍及用于回归感染的健康鲍于2014年4月分别采自南日岛的两个鲍鱼养殖场，前者为4.0～6.5cm壳长的病症明显的濒临死亡的南日鲍，后者为5.5～7.0cm壳长的无病症、健康的南日鲍。

1.2方法

1.2.1病原菌分离培养

取上述病鲍，先用70%酒精消毒鲍的体表，再取鲍的足部病灶区和消化腺，稍剪碎，放在匀浆器中匀浆，后接种到硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(TCBS)及胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)上，倒置于26℃恒温培养箱中进行24h左右细菌培养(以长出菌落为准)，经划线分离、纯化培养后获得一株优势菌，标记为201404-Ⅰ，扩大培养到一定数量后，用于以下的试验。

1.2.2回归感染试验

取健康南日鲍，放置于16个盛有25L经沙过滤海水的塑料桶中，每桶10只，水温保持在26℃，连续充气，根据水质状况每天适当换水。待鲍正常活动、摄食后，开始进行感染试验，回归感染试验包括浸浴感染试验和注射感染试验。

浸浴感染试验是将上述纯化后扩大培养的细菌用无菌海水稀释计数(血球计数板直接计数)后加入桶中，设置细菌浓度为1.5×108、1.5×107和1.5×106cfu/mL三个试验组和一个对照组，每组设两个平行组，浸浴24h后移入盛有25L沙滤海水的塑料桶中在自然温度下饲养观察10d。

注射感染试验设置注射的菌液浓度分为1.5×109、1.5×108和1.5×107cfu/mL三个试验组，每只鲍注射0.1mL，以注射0.1mL生理盐水作为对照组，每组设两个平行组，在自然温度下继续饲养观察10d。

在上述的浸浴感染和注射感染试验中，取濒临死亡鲍的足部病灶及消化腺进行病原菌再分离。

1.2.3细菌鉴定及药敏试验

采用法国生物-梅里埃的ID32E试剂条和杭州微生物试剂有限公司生产的革兰氏染色液、氧化酶试验试剂进行生理生化特征的测定；药敏试验采用ATBVET试剂条、ATBG-5试剂条和杭州微生物试剂有限公生产的弧菌抑制剂0/129及氟苯尼考药敏纸片，按说明书进行测定。

2　结果

2.1病鲍症状

现场观察，病鲍发病初期，没有明显的症状，发病持续一段时间后足部表面有大小不一的溃烂孔。发病水温为22℃以上。

2.2细菌分离培养及形态特征

经划线分离、纯化培养后获得201404-Ⅰ菌株，该菌经26℃恒温培养24h后，在TCBS平板上菌落为黄色、圆形、中间略凸、湿润；在TSB平板上的菌落略显透明、无色、湿润。26℃恒温培养时，TCBS平板上菌落的生长速度比TSA平板上的快。

2.3回归感染试验

表1为回归感染结果，在浸泡感染试验中，感染1d后各试验组均没有死亡，试验结束时，1.5×108cfu/mL试验组的死亡率为10%，其余各试验组均没有死亡，感染率随着浸泡浓度的增加而上升，病鲍表现的症状为足部肌肉发白、出现水泡后溃烂。在注射感染试验中，注射剂量1.5×108cfu/ind试验组及1.5×107cfu/ind试验组感染1d后死亡率分别为10%和5%，注射剂量为1.5×106cfu/ind试验组感染1d后无死亡，感染1～4d后死亡的个体没有任何症状，第5天开始死亡的个体出现水泡溃烂等症状，死亡率和感染率随注射剂量的增加而增加。注射感染引起南日鲍死亡速度快于浸泡感染。

表1　不同浓度的菌株201404-Ⅰ感染南日鲍的结果

在浸浴感染和注射感染试验后的濒死的南日鲍足部及消化腺中再次分离得到一种菌，标记为201404-Ⅱ，菌落形态与201404-Ⅰ相同。回归感染结果证实菌株201404-Ⅰ为引起南日鲍死亡的病原菌。

2.4细菌鉴定

经观察，201404-Ⅰ和201404-Ⅱ为革兰氏阴性杆菌，极端具有单鞭毛，对弧菌抑制剂0/129表现敏感。

表2为生化测定结果，菌株201404-Ⅰ和201404-Ⅱ生化特征相同，根据这些生化特征，按照法国生物-梅里埃全自动细菌鉴定仪的鉴定方法，判定这两株菌为溶藻弧菌，可信度为 99.9%。

表2　菌株201404-Ⅰ和201404-Ⅱ生化特征

注：“+”为阳性；“-”为阴性。

Note：+indicatedpositive，-indicatednegative.

2.5药敏试验

本次试验对菌株201404-Ⅰ进行了43种抗菌药物抑菌试验，菌株201404-Ⅰ对阿莫西林、哌拉西林、头孢噻肟、头孢吡肟、大观霉素、依氟沙星、安普霉素、利福平、阿莫西林、克拉维酸、哌拉西林-他唑巴坦、头孢西丁、头孢他啶、奥索利酸、妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、奈替米星、氟甲喹、卡那霉素、呋喃妥因、氟苯尼考等21种药物敏感，结果如表3所示。

表3　菌株201404-Ⅰ的药敏试验结果

注：“S”为敏感；“R”为耐药。

Note：Sindicatedsensitive，Rindicatednosensitive.

3　讨论

南日鲍感染溶藻弧菌后的症状，与闽南沿海养鲍场由哈维氏孤菌引起的鲍溃烂病[4]及由河流孤菌引起的皱纹盘鲍脓疱病症状[8]相似，三者病鲍足部均出现水泡、溃烂等症状，但致病菌不同，可见不同地区、不同的鲍种类虽然病症相同，但病因存在明显的差异，有多种病因可引起鲍鱼足部溃烂，在生产上必须进行严格区分，做到对症下药。

溶藻弧菌为条件性致病菌，可引起多种养殖种类暴发弧菌病，其致病性与养殖品种的抗病力及养殖的环境条件有关[9]，近几年来南日鲍弧菌病的暴发可能与养殖海区水质恶化、养殖密度过高及种质退化有关。

引起东山九孔鲍(H.diversicolor supertexta)发病的溶藻弧菌对链霉素和氯霉素敏感[7]；引起大黄鱼(Pseudosciaena crocea)溃疡病的溶藻弧菌对复方新诺明、庆大霉素敏感[9]；本次试验进行了43种抗菌药物对溶藻弧菌的抑菌试验，得出了溶藻弧菌对庆大霉素敏感而对链霉素、氯霉素和复方新诺明不敏感的结论。可见在不同地区及不同养殖品种，同一种的病原菌对抗菌药具有不一样的敏感性，在生产上治疗南日鲍弧菌病时，必须每次进行药敏试验，筛选出适宜的敏感性药物。

本次试验共筛选出阿莫西林-哌拉西林、头孢噻肟、头孢吡肟、大观霉素、依氟沙星、安普霉素、利福平、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林、他唑巴坦、头孢西丁、头孢他啶、奥索利酸、妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、奈替米星、氟甲喹、卡那霉素、呋喃妥因、氟苯尼考等21种敏感药物，但根据目前我国渔药使用的相关标准及法规[10]，在这21种敏感药物中生产上允许使用的药物仅有氟甲喹和氟苯尼考两种。

[1]石贤爱，张利，刘震.南日鲍β-葡萄糖苷酶分离纯化及表征[J].福州大学学报：自然科学版，2014，42(3)：480-485.

[2]王军，苏永全，张蕉南，等.春季东山九孔鲍暴发性病害研究[J].厦门大学学报：自然科学版，1999，38(5)：1-4.

[3]OtsuR，SasakiK.Virus-likeparticlesdetectedfromjuvenileabalones(Nordotis discus discus)rearedwithanepizooticfatalwastingdisease[J].JournalofInvertebratePathology，1997，70(2)：167-168.

[4]陈月忠，黄万红，蔡清海.闽南地区鲍溃烂病的研究[J].福建水产，2008，12(4)：31-37.

[5]畑井喜司雄.蓄養フヮヒかケ分離きゎた Haliphthoros milfordensis につぃて[J].魚病研究，1982，17(3)：199-204.

[6]Lester，RJG，Davis，GHG.AnewPerkinsusSpecies(Apicomplexa，Perkinsea)fromtheabaloneHaliotis rubber [J].JournalofInvertebratePathology，1981，37(2)：181-187.

[7]张朝霞，王军，张蕉南，等.东山九孔鲍细菌性疾病研究[J].台湾海峡，2001，20(2)：193-198.

[8]聂丽平，刘金屏，李太武，等.皱纹盘鲍脓疱病的防治方法初探[J].海洋科学，1995，(5)：4-5.

[9]郑天伦，王国良，金珊，等.养殖大黄鱼溃疡病的病原菌及其防治药物研究[J].南方水产，2006，2(1)：5-10.

[10]孟思妤，孟长明，陈昌福.抗生素类渔药的问题与对策(一) [J].科学养鱼，2010，(6)：77.

Isolation and identification of a pathogen from Haliotis discus nanri

YAN Zhihong

(PutianXiuyuAquacultureTechnicalPromotionStation，Putian351146，China)

TheoccurrenceofdiseaseisbecomingmoreandmoreseriouswiththeexpansionofHaliotis discusnanribreedingscale，butsofarnospecialreportsfocusontheresearchofthesediseases.InordertoprovidesomebasicinformationfordiseasepreventionandcontrolofH. discusnanri，adominantbacteriastrainwasisolatedfromthefootlesionsanddigestiveglandofobviouslydyingindividualswhichwereshowingovertsymptomsandprovedtobethepathogenbyrecurrentinfectionexperiment.Thediseasesymptomofthepathogenicbacteriawasobservedcarefullywhilebiochemicalcharacteristicsanddrugsusceptibilitytestofthepathogenicbacteriawerealsodetectedseparately.Itturnedoutthatthediseasesymptomwasnotsignificantlyattheinitialstage，andfesteringholesofdifferentsizescouldbejustfoundonthefootofH.discusnanriafteraperiodoftime.TheresultsofphysiologicalandbiochemicalanalysesshowedthepathogenwasVibrio alginolyticuswhichwassensitiveto21kindsofantibioticssuchasflumequineandflorfenicolandsoon.IthighlyrecommendthatdrugsensitiveexperimentshouldbenecessarytocarryouteverytimewiththepurposeofscreeningouttheappropriateeffectivedrugstopreventandcontroltheV. alginolyticusinH. discusnanriproductionprocess.

Haliotis discusnanri；Vibrio alginolyticus；drugsusceptibilitytests

2015-06-15

莆田市科技局项目(2014N07).

严志洪(1967-)，男，大学本科，高级工程师，主要从事水产养殖技术推广与海水增养殖研究.Tel：0594-5860865.E-mail：13850289126@126.com

S944.4

A

1006-5601(2016)01-0021-06

严志洪.一例引起南日鲍死亡的病原分离与鉴定[J].渔业研究，2016，38(1)：21-26.