新型苯甲酰胺类HDAC抑制剂的合成及其抗肿瘤活性

于清华, 李俊明,, 赵砚瑾, 刘意林 , 江发龙, 李庶心*,

(1. 江西中医药大学　研究生部,江西 南昌　330006; 2. 军事医学科学院 放射与辐射医学研究所,北京　100850)



·研究论文·

新型苯甲酰胺类HDAC抑制剂的合成及其抗肿瘤活性

于清华1, 李俊明1,2, 赵砚瑾2, 刘意林1, 江发龙1, 李庶心1*,

(1. 江西中医药大学研究生部,江西 南昌330006; 2. 军事医学科学院 放射与辐射医学研究所,北京100850)

以MS-275为先导化合物,设计并合成了7个新型苯甲酰胺类化合物(6a～6c, 14a, 14b, 15a和18)，其结构经1H NMR和ESI-MS表征。采用MTT法测定了6a～6c, 14a, 14b, 15a和18对人急性白血病细胞(HL60)和人乳腺癌细胞(MCF-7)的体外抗肿瘤细胞增殖活性。结果表明：N-(2-氨基苯)-3-[4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-氨基]己酰胺(6a),N-(2-氨基苯)-4-【3-{4-[(二乙胺基)甲基]苯基}丙烯酰】苯甲酰胺(14a)和N-(2-氨基苯)-4-[3-(吡啶-3-基)丙烯酰]丙酰胺(18)的抑制活性较好，其GI50依次为5.72 μmol·L-1, 6.91 μmol·L-1, 7.11 μmol·L-1和3.46 μmol·L-1, 4.12 μmol·L-1, 3.97 μmol·L-1,优于MS-275(7.88 μmol·L-1和4.49 μmol·L-1)。

MS-275; 苯甲酰胺; 组蛋白去乙酰化酶抑制剂; 合成; 抗肿瘤活性

近年来，组蛋白去乙酰化酶(HDAC)已成为治疗癌症最热门和最有效的靶标之一。HDAC抑制剂作为一类新型的抗肿瘤药物，可通过诱导肿瘤细胞生长停滞、分化或凋亡，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的效果,且对正常细胞作用毒性较低[1-3]。目前，HDAC类抑制剂品种较少，生产技术大多被国外机构垄断，价格较高。因此，研发具有自主知识产权的新型HDAC 抑制剂具有较大的实际意义[4-6]。

Mitsui Chemicals公司开发的苯甲酰胺类化合物物MS-275【化学名为N-【【4{[( 2-氨基苯基) 氨基]甲酰}苯基】甲基】氨基甲酸-3-吡啶基甲基酯, Chart 1】是首个被证明在动物体内具有口服抗癌活性的低毒HDAC抑制剂，虽然该药目前在美国已进入白血病、晚期淋巴癌及实体瘤的Ⅱ 期临床研究阶段，但仍然存在选择性较低，毒性较大，不良反应较多等缺点[7-10]。

Scheme 1

本文在课题组前期研究的基础上，根据苯甲酰胺类HDAC 抑制剂的结构特点，在保留“连接区”的刚柔性结构特征的同时，通过在表明识别区引入吡嗪环，利用“插烯规律”改变连接区长度，考察延长连接区长度对抗肿瘤活性的影响。此外，还通过修饰酶抑制区结合基团，以期提高抗肿瘤活性。以MS-275为先导化合物,设计并合成了7个新型苯甲酰胺类化合物(6a～6c, 14a, 14b, 15a和18, Scheme 1)，其结构经1H NMR和ESI-MS表征。采用MTT法测定了6a～6c, 14a, 14b, 15a和18对人急性白血病细胞(HL60)和人乳腺癌细胞(MCF-7)的体外抗肿瘤细胞增殖活性。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

RY-1型熔点仪(温度未校正)；JNM-ECA-400型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标);Q-TOF型质谱仪。

所用试剂均为分析纯。

1.2合成

(1) 2a～2c的合成(以2c为例)

在单口瓶中加入甲基异硫脲硫酸盐5.3 g和1 mol·L-1NaOH溶液20 mL,搅拌使其溶解；冰浴下缓慢滴加6-氨己酸(1c)5 g，滴毕，搅拌下于室温反应过夜。析出白色固体，过滤，滤饼干燥得白色固体6-胍基己酸(2c)6 g，收率75%, m.p.>250 ℃。

用类似的方法合成白色固体2a, 2b，收率74.3%, 76.3%, m.p.>250 ℃。

(2) 3,3-二甲基氨基-1-吡啶-3-基-丙烯酮(4)的合成

在反应瓶中加入3-乙酰吡啶(3)20 g和DMF 50 mL，搅拌使其溶解；滴加DMA 50 mL，滴毕，于110 ℃反应3 h(薄层层析检测)。减压回收DMF，残余物置于冰箱中过夜，析出黄色固体，抽滤，滤饼用混合溶剂[V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶1]洗涤得黄色固体4 22 g，收率75.9%, m.p.75～78 ℃。

(3) 5a～5c的合成(以5c为例)

在单口瓶中加入2c 4 g, 4 4 g, K2CO34 g和无水异丙醇100 mL，搅拌使其溶解；回流反应48 h。冷却至室温，滤除不溶物，滤液减压蒸除溶剂，残余物用水(15 mL)溶解，用浓盐酸调至pH 4～5，析出大量白色固体，抽滤得白色固体6-[4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-氨基]己酸(5c)1.6 g，收率26.2%, m.p.>250 ℃。

用类似的方法合成白色固体5a和5b。

(4) 6a～6c的合成(以6c为例)

氮气保护下，在三口瓶中加入5c 0.38 g, EDCl 0.23 g和无水THF 20 mL，搅拌使其溶解；加入邻苯二胺0.2 g，冰浴下滴加三乙胺0.12 g，搅拌10 min，于室温反应过夜(TCL检测)。减压回收溶剂，残余物经硅胶柱层析[洗脱剂A:V(二氯甲烷) ∶V(甲醇)=10 ∶1]纯化后浓缩，残余物析晶得淡灰色固体N-(2-氨基苯)-6-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-氨基)己酰胺(6c)0.12 g，收率55.6%, m.p.167～174 ℃。

用类似的方法合成淡灰色固体N-(2-氨基苯)-3-[4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-氨基]己酰胺(6a)，收率81.6%, m.p.160～164 ℃和淡灰色固体N-(2-氨基苯)-4-[4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-氨基]己酰胺(6b)，收率78.3%, m.p.163～168 ℃。

6a:1H NMRδ: 2.587(m, 2H), 3.666(s, 2H), 4.860(s, 2H), 6.519(t,J=3.7 Hz, 1H), 6.702(d,J=3.6 Hz, 1H), 6.886(t,J=4.5 Hz, 1H), 7.154(d,J=3.6 Hz, 1H), 7.257(d,J=2.6 Hz, 1H), 7.389(t,J=2.6 Hz, 1H), 7.550(q,J=3.2 Hz, 1H), 8.425(m, 2H), 8.695(m, 1H), 9.157(s, 1H), 9.299(m, 1H); ESI-MSm/z: 334{[M+H]+}。

6b:1H NMRδ: 1.903(d,J=6.2 Hz, 2H), 2.412(t,J=7.2 Hz, 2H), 3.424(s, 2H), 4.841(s, 2H), 6.522(m,J=7.4 Hz, 1H), 6.708(m, 1H), 6.883(m, 1H), 7.187(m, 2H), 7.390(t,J=6.9 Hz, 1H), 7.517(t,J=7.6 Hz, 1H), 8.415(m, 2H), 8.687(m, 1H), 9.119(s, 1H), 9.275(s, 1H); ESI-MSm/z: 348{[M+H]+}。

6c:1H NMRδ: 2.587(m, 2H), 3.666(s, 2H), 4.860(s, 2H), 6.519(t,J=3.2 Hz, 1H), 6.702(d,J=3.6 Hz, 1H), 6.886(t,J=3.6 Hz, 1H), 7.154(d,J=3.6 Hz, 1H), 7.257(d,J=2.6 Hz, 1H), 7.389(t,J=2.3 Hz, 1H), 7.550(q,J=3.2 Hz, 1H), 8.425(m, 2H), 8.695(m, 1H), 9.157(s, 1H), 9.299(m, 1H); ESI-MSm/z: 376{[M+H]+}。

(5) 对甲基苯丙烯酸乙酯(8)的合成

搅拌下，在反应瓶中加入对甲基苯甲醛12 g，丙二酸15 g和吡啶8 g，回流反应4 h。冷却至室温，过滤，滤饼用冰水(2×30 mL)洗涤，干燥得4-甲基苯丙烯酸粗品7 15 g，不需纯化，直接投入下步反应。

在单口瓶中加入7 10 g，无水乙醇80 mL和氯化亚砜10 mL，回流反应3 h。减压蒸除溶剂得淡黄色油状液体8 12 g，收率61.9%。

(6) 二乙胺甲基苯丙烯酸乙酯(10)的合成

在三口瓶中加入8 10 g, NBS 9.8 g,无水四氯化碳80 mL和催化量过氧化苯甲酰(BPO)，回流反应6 h。过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物用乙酸乙酯溶解，依次用水(2×50 mL)，饱和食盐水(50 mL)洗涤，无水硫酸钠干燥得淡黄色油状液体4-溴甲基苯丙烯酸乙酯(9)15 g，不需纯化，直接投入下步反应。

在单口瓶中加入二乙胺乙醇8 mL和二氯甲烷60 mL，冰浴下滴加9 14 g的二氯甲烷(10 mL)溶液,滴毕，于室温反应3 h。加入饱和碳酸钠溶液50 mL，分液，水相用二氯甲烷(3×50 mL)萃取，合并有机相，用饱和食盐水(2×50 mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸除溶剂得淡黄色膏状固体10 12 g，收率71.4%。

(7) 4-二乙胺甲基苯丙烯酸(11)的合成

在单口瓶中加入10 10 g, 3 mol·L-1NaOH溶液40 mL和THF 20 mL，于45 ℃反应3 h。减压蒸除THF，残余物用稀盐酸调至pH 7，析出白色固体，过滤，滤饼依次用水(3×50 mL)和乙醇(50 mL)洗涤，干燥得淡黄色固体11 5.2 g，收率79.2%, m.p.>250 ℃。

(8) 13a～13c的合成(以13a为例)

在单口瓶中加入11 5 g, CDI 5.2 g和THF 60 mL，于45 ℃反应16 h(TLC检测)。冷却得反应液A。

在三口瓶中加入对氨基苯甲酸(12a)2.9 g和2 mol·L-1NaOH溶液10 mL，搅拌使其溶解；倒入A中，于室温反应12 h。减压蒸除溶剂，用稀盐酸调至pH 7,抽滤，滤饼用乙醇(2×20 mL)洗涤，干燥得灰白色固体4-【3-{4-[(二乙胺基)甲基]苯基}丙烯酰】苯甲酸(13a)2.2 g，收率23.9%, m.p.>250 ℃。

用类似的方法合成灰白色固体13b 2.3 g，收率31.2%, m.p.>250 ℃,灰白色固体13c 6.1 g，收率49.2%, m.p.>250 ℃。

(9) 14a～14b的合成(以14a为例)

在单口瓶中加入13a 2 g, CDI 1.4 g和THF 60 mL，于45 ℃反应14 h(TLC检测)。冷却得反应液B。

在三口瓶中加入邻苯二胺0.6 g和THF 10 mL，搅拌使其溶解；加入三氟乙酸1.3 g，搅拌5 min后加入B中，于45 ℃反应12 h。减压蒸除大部分有机溶剂，用碳酸氢钠调至pH 8～9,加入乙酸乙酯80 mL，分液，水相用乙酸乙酯(3×50 mL)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤饼经硅胶柱层析(梯度洗脱剂:A=10 ∶1～1 ∶1)纯化得灰色固体N-(2-氨基苯)-4-【3-{4-[(二乙胺基)甲基]苯基}丙烯酰】苯甲酰胺14a 0.27 g，收率10.4%, m.p. 234～238 ℃。

用类似的方法合成灰白色固体N-(2-氨基苯)-4-【3-{4-[(二乙胺基)甲基]苯基}丙烯酰】苯甲酰胺(14b)，收率9.2%, m.p.227～232 ℃。

(10) 4-【3-{4-[(二胺乙基)甲基]苯基}丙烯】异羟肟酸(15a)的合成

在锥形瓶中加入盐酸羟胺0.1 mol和无水甲醇100 mL，冰浴下分3批加入KOH 0.1 mol，搅拌30 min；静置1 h，过滤得滤液C。

在三口瓶中加入13a的甲酯盐酸盐1.0 g和甲醇20 mL，搅拌使其溶解；加入KOH 0.14 g，搅拌5 min；滴加C 2.5 mL，滴毕，于室温反应12 h。减压蒸除大部分有机溶剂，残余物用混合溶剂[V(乙醇) ∶V(乙酯)=1 ∶1]10 mL溶解，通入干燥HCl，过滤，滤液蒸干后用甲醇重结晶得淡黄色固体15a 0.12 g，收率11.5%, m.p.>250 ℃。

(11) 3-吡啶丙烯酰氯(16)的合成

在单口瓶中加入3-吡啶丙烯酸10 g和氯化亚砜80 mL，回流反应3 h。减压蒸除氯化亚砜得灰白色固体16 11 g,收率98.2%, m.p.>250 ℃。

(12) 4-[3-(吡啶-3-基)丙烯酰]丁酸(17)的合成

在反应瓶中加入4-氨基丁酸2 g和DMF 50 mL，搅拌使其溶解；加入三乙胺6 g，冰浴下分3批加入16 4 g，加毕，反应30 min；于室温反应6 h(TLC检测)。剧烈搅拌下，将反应液倒入冰水中，析出白色固体，抽滤，滤饼用混合溶剂[V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶1]洗涤得黄色固体17 3.1 g,收率55.4%, m.p.248～251 ℃。

(13)N-(2-氨基苯)-4-[3-(吡啶-3-基)丙烯酰]丙酰胺(18)的合成

氮气保护下，在三口瓶中加入16 1.0 g,邻苯二胺0.5 g, EDCl 0.9 g和无水THF 30 mL，搅拌使其溶解；冰浴下滴加三乙胺1.1 g，搅拌10 min，于室温反应过夜(TLC检测)。减压回收溶剂，残留物经硅胶柱层析(洗脱剂：A)纯化后浓缩，残余物析晶得灰白色固体18 0.42 g，收率30.4%, m.p.184～186 ℃。

14a:1H NMRδ: 0.984(m, 6H), 2.501(m, 4H), 3.318(s, 2H), 6.836(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.167(s, 1H), 7.398(d,J=3.8 Hz, 2H), 7.621(t,J=7.6 Hz, 3H), 7.684(d,J=7.4 Hz, 1H), 7.859(dd,J=4.4 Hz, 11.2 Hz, 2H), 7.936(s, 2H), 8.237(s, 1H), 10.652(s, 1H) ; ESI-MSm/z: 526{[M+H]+}。

14b:1H NMRδ: 0.980(s, 6H), 2.500(s, 4H), 4.260(d,J=3.6 Hz, 2H), 5.250(s, 2H), 3.547(s, 2H), 4.480(d,J=4.0 Hz, 2H), 4.880(s, 2H), 6.680(m, 3H), 6.970(t,J=2.6 Hz, 1H), 7.165(d,J=2.0 Hz, 1H), 7.455(m, 7H), 7.950(d,J=4.0 Hz, 2H); ESI-MSm/z: 560{[M+H]+}。

15:1H NMRδ: 1.260(m, 3H), 3.030(d,J=4.0 Hz, 2H), 4.315(d,J=4.0 Hz, 1H), 7.045(m, 1H) , 7.760(m, 5H), 10.835(m, 1H), 11.180(m, 1H); ESI-MSm/z: 451{[M+H]+}。

18:1H NMRδ: 1.804(m, 2H), 2.366(t,J=3.6 Hz, 2H), 3.256(m, 2H), 6.527(t,J=9.5 Hz, 1H), 6.728(d,J=10.4 Hz, 1H), 6.888(t,J=4.6 Hz, 1H), 7.157(d,J=3.8 Hz, 1H), 7.433(d,J=1.2 Hz, 2H), 7.939(d,J=4.0 Hz, 1H), 8.247(m, 1H), 8.552(d,J=2.4 Hz, 1H), 8.759(s, 1H), 9.101(s, 1H); ESI-MSm/z: 522{[M+H]+}。

1.3体外抗肿瘤增殖活性测试

以MS-275 为阳性对照物，采用MTT法测定了6a～6c, 14a, 14b, 15a和18对人急性白血病细胞(HL60)和人乳腺癌细胞(MCF-7)的体外抗肿瘤细胞增殖活性。取对数生长期的细胞制成细胞悬液，以2～4×104个/mL的细胞密度接种于96孔培养板上，每孔180 μL。于37 ℃, 5%CO2的温箱中孵育24 h。将待测化合物加入96孔板中，继续培养2 d。将MTT溶液5 mg·mL-1加入96孔板中，每孔20 μL，于37 ℃温育4 h。吸出上清液，每孔加入DMSO 200 μL，用平板摇床摇匀，用自动分光光度计读取波长490 nm处吸光度值A490，计算待测化合物的半数增殖抑制浓度(GI50)。

2　结果与讨论

2.1体外抗肿瘤增殖活性

表1为6a～6c, 14a, 14b, 15a和18对HL60和MCF-7的体外抗肿瘤细胞增殖活性。

表1　化合物对肿瘤细胞的抑制活性

由表1可见，6a, 14a和18的抑制活性较好，其GI50依次为5.72 μmol·L-1, 6.91 μmol·L-1, 7.11 μmol·L-1和3.46 μmol·L-1, 4.12 μmol·L-1, 3.97 μmol·L-1,优于MS-275(7.88 μmol·L-1和4.49 μmol·L-1)。其可能原因为：在酶结合区引入吡嗪环和碳碳双键在一定程度上增加了化合物对肿瘤细胞的抑制活性；在酶抑制区引入异羟肟酸结构和延长连接区脂肪链长度均不利于提高抑制活性。

以MS-275为先导化合物,设计并合成了7个新型苯甲酰胺类化合物(6a～6c, 14a, 14b, 15a和18)。抗肿瘤活性测试结果表明：N-(2-氨基苯)-3-[4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-氨基]己酰胺(6a),N-(2-氨基苯)-4-【3-{4-[(二乙胺基)甲基]苯基}丙烯酰】苯甲酰胺(14a)和N-(2-氨基苯)-4-[3-(吡啶-3-基)丙烯酰]丙酰胺(18)的抑制活性较好，其GI50依次为：5.72 μmol·L-1, 6.91 μmol·L-1, 7.11 μmol·L-1和3.46 μmol·L-1, 4.12 μmol·L-1, 3.97 μmol·L-1,优于MS-275(7.88 μmol·L-1和4.49 μmol·L-1)。本研究对优化苯甲酰类抗肿瘤药物结构有一定借鉴意义。

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Synthesis and Antitumor Activities of Benzamide Histone Deacetylase Inhibitors

YU Qing-hua1,LI Jun-ming1,2,ZHAO Yan-jin2,LIU Yi-lin1,JIANG Fa-long1,LI Shu-xin1*

(1. Department of Postgraduate， Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330006， China；2. Institute of Radiation and Irradiation Medicine， Academy of Military Medical Science， Beijing 100850， China)

Seven novel benzamide compounds(6a～6c, 14a, 14b, 15a and 18) were designed and synthesized using MS-275 as the leading compound. The structures were characterized by1H NMR and ESI-MS. Theinvitroantitumor activities of 6a～6c, 14a, 14b, 15a and 18 against human acute leukemia cells(HL60) and human breast cancer cells(MCF-7) were investigated by MTT method. The results indicated that 6a, 14a and 18 showed good inhibition activities with GI50of 5.72 μmol·L-1, 6.91 μmol·L-1, 7.11 μmol·L-1and 3.46 μmol·L-1, 4.12 μmol·L-1, 3.97 μmol·L-1, better than MS-275(7.88 μmol·L-1and 4.49 μmol·L-1).

MS-275; benzamide; histone deacetylase inhibitor; synthesis; antitumor activity

2015-09-15;

2016-05-31

国家自然科学基金资助项目(30772628)

于清华(1990-)，男，汉族，山东威海人，硕士研究生，主要从事药物分子的设计与合成研究。

通信联系人： 李庶心，研究员， E-mail: lisx28@163.com

O625.6; O626.3

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.08.15306