姜黄素对A549细胞亚群SP和NON-SP的NF-κB、VEGF及Notch通路的影响*

李小江，贾英杰，张文治，张莹，许文婷（.天津中医药大学第一附属医院，天津009；.天津神经外科研究所，天津00060；.天津中医药大学研究生院，天津009）

姜黄素对A549细胞亚群SP和NON-SP的NF-κB、VEGF及Notch通路的影响*

李小江1，贾英杰1，张文治2，张莹1，许文婷3
（1.天津中医药大学第一附属医院，天津300193；2.天津神经外科研究所，天津300060；3.天津中医药大学研究生院，天津300193）

［目的］通过动物实验了解姜黄提取物-姜黄素抗肿瘤血管生成的具体作用机制。［方法］将40只BALB/C雄性裸小鼠分为4组，每组10只。分别为A组（SP亚群细胞姜黄素组）、B组（SP亚群细胞荷瘤对照组）、C组（NONSP亚群细胞姜黄素组）、D组（NON-SP亚群细胞荷瘤对照组）。A、B两组于实验前建立肺腺癌A549 SP细胞亚群荷瘤模型，C、D两组建立肺腺癌A549 NON-SP细胞亚群荷瘤模型，建立模型后观察16 d，于A组、C组小鼠腹腔注射姜黄素，隔天1次，B、D两组注射生理盐水。16 d后将小鼠称重后处死，剥离瘤块组织，比较各组瘤质量；免疫组化法检测肿瘤组织中血管生长因子（VEGF）、核因子-κB（NF-κB）的表达；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测Notch1 mRNA含量。［结果］肺腺癌A549 SP细胞亚群荷瘤模型组小鼠瘤体与NON-SP细胞亚群荷瘤模型组小鼠相比体积较大；SP亚群细胞姜黄素组抑瘤作用及抗肿瘤血管生成优于NON-SP亚群细胞姜黄素组，两组相比差异具有统计学意义。［结论］姜黄素可以抑制肿瘤生长，考虑可能与其抑制NF-kB的表达，下调Notch1 mRNA含量，阻断Notch信号通路，抑制肿瘤组织中VEGF的表达有关。

姜黄素；血管生长因子；核因子-κB；人肺腺癌A549；NON-SP细胞；SP细胞

姜黄色素（Curcumin）是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酚性色素，是姜黄发挥作用的主要活性成分。研究表明，姜黄素具有抗炎、抗氧化、调节血脂、抗肿瘤、调节机体免疫功能、保护肝肾等多种药理作用。血管生成是实体肿瘤生长、侵袭、扩散和转移的关键，是肿瘤治疗的靶点之一［1］。近年来研究表明姜黄素具有抗肿瘤血管生成的作用，但具体机制仍不明确［2］。本实验旨在研究姜黄素抗肿瘤血管生成作用及机制。

1　材料

1.1材料BALB/C裸小鼠、人肺腺癌A549瘤株，上海坤肯生物化工有限公司；SP（side population）亚群细胞，天津灏洋生物公司提供；NON-SP（NON-side population）亚群细胞，由天津灏洋生物公司提供；姜黄素，天津化标生物技术有限公司。

1.2仪器及试剂Notch1逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒、生物显微镜，LYMPUS-BX40日本；电子分析天平，梅特勒-托得多仪器设备有限公司；低温高速离心机，BECKMAN allegraTM64 Centrifuge；MDF-192型超低温冰箱，日本三洋电机株式会社；PCR仪，Alpha unit Block Assembly for PTC DNA Engine Systems；超净工作台，苏州净化设备有限公司。

2　方法

2.1实验方法取BALB/C裸小鼠40只，按照随机数字表分为4组，每组10只。分为SP亚群细胞和NON-SP亚群细胞两组，每组分别设为姜黄素组及荷瘤空白对照组。具体分组情况如下：A组（SP亚群细胞姜黄素组）、B组（SP亚群细胞荷瘤对照组）、C组（NON-SP亚群细胞姜黄素组）、D组（NON-SP亚群细胞荷瘤对照组）4组。

2.2动物模型建立取分离后的A549 SP亚群细胞及NON-SP亚群细胞调整细胞数为1×109/L癌细胞悬液，取0.2 mL原液常规方法将SP亚群细胞接种于A、B组小鼠左、右大腿内侧皮下，将NON-SP亚群细胞接种于C、D组小鼠左、右大腿内侧皮下。

2.3给药及标本制备各组均于接种瘤株16 d后采用腹腔注射给药，隔日1次，共8次。实验组予姜黄素腹腔注射100 mg/kg，0.2 mL；对照组予生理盐水腹腔注射25 mL/kg，隔日1次，共8次。实验动物均于接种瘤株16 d后称质量，处死小鼠，立即将瘤块组织剥离，称重测量大小后用甲醛固定并进行常规石蜡包埋，切片5 μm，免疫组织化学染色。免疫组织化学用SP法，按试剂说明书操作，二氨基联苯胺（DAB）显色，磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照。免疫组化染色阳性为棕色或黄褐色。

2.4免疫组化法检测血管生长因子（VEGF）、核因子-κB（NF-κB）的表达二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，3%双氧水灭活内源性过氧化酶，PBS振洗，采用专用微波炉进行抗原微波热修复，正常山羊血清封闭、一抗冰箱过夜，二抗、三抗各37℃孵育45 min，DAB显色2 min，复染核脱水透明，中性树胶封片。

2.5RT-PCR检测Notch1表达组织总RNA的变性，抽提，沉淀，洗涤，溶解，NOTCH1引物长度：182 bp上游引物：5'TCC GCG GCT CCA TCG TCT ACC 3'下游引物：5'CTG CAC GGC CTC GAT CTT GTA 3'；β-actin扩增长度169 bp上游引物5'GCA CCC AGC ACA ATG AAG ATC 3'下游引物5'CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC 3'；RT反应后，目的基因退火，1%Agrose凝胶电泳检测PCR反应产物。

2.6统计学处理方法采用SPSS 18.5统计软件处理数据，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANONA），组间两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnet’s T3法，P＜0.05为差异有统计学意义。

3　结果

3.1小鼠一般情况及瘤体比较实验后4组小鼠体质量均出现不同程度的下降，与实验前比较，差异具有统计学意义。A组、B组两组小鼠瘤体质量较大，且与C、D两组比较，差异具有统计学意义，其中B组瘤质量大于A组，D组瘤质量大于C组，说明SP细胞肿瘤组织较NON-SP生长速度快，并且姜黄素对肿瘤组织的生长具有一定的抑制作用，A、B两组及C、D两组组间比较差异均具有统计学意义。结果见表1。

表1　各组小鼠瘤质量比较（±s）Tab.1Comparison of tumor weight of each group of mice（±s）

表1　各组小鼠瘤质量比较（±s）Tab.1Comparison of tumor weight of each group of mice（±s）

注：B组与其他3组比较，*P＜0.05；B组与C组、D组比较，**P＜0.01；A组与B组、C组与D组比较，*P＜0.05。

组别动物数瘤质量（g）A组101.009±0.376* B组101.289±0.238** C组100.746±0.301* D组100.837±0.289*

3.2对小鼠肿瘤组织中VEGF的表达的影响在积分光度中，A、C两组明显低于C、D两组，其中A组最低，与其他各组比较，差异具有统计学意义，A组与C组比较，差异具有统计学意义，B、D两组比较，差异不具有统计学意义。总面积结果与积分光度大体一致。说明姜黄素可以明显抑制VEGF的表达，并且姜黄素对SP亚群细胞荷瘤组的VEGF的表达最低。结果见表2、图1。

表2　各组小鼠肿瘤组织VEGF图像分析结果（±s）Tab.2VEGF image analysis results in tumor tissue of each group（±s）

表2　各组小鼠肿瘤组织VEGF图像分析结果（±s）Tab.2VEGF image analysis results in tumor tissue of each group（±s）

注：在积分光度中，A组与B、D两组比较，△△P＜0.01；A组与C组比较，△P＜0.05；B、D两组比较，*P＞0.05；C组与B、D两组比较，#P＜0.01。在总面积中，A组与B、D两组比较，△△P＜0.01；A组与C组比较，△P＜0.05；B、D两组比较，*P＞0.05；C组与B、D两组比较，#P＜0.01。

组别动物数积分光度总面积（μm2）A组10198.21±5.89143.23±2.84 B组10365.54±7.26△△175.65±3.89△△C组10223.76±4.53△#163.86±1.08△#D组10342.22±3.42△△*188.64±3.86△△*

3.3对小鼠肿瘤组织中NF-κB表达的影响NF-κB在A组中表达最低，其次为C组，两组比较，差异不具有统计学意义，A组与B、D两组比较，差异具有统计学意义。B、D两组NF-κB在小鼠肿瘤组织中表达较高，但两组比较差异不具有统计学意义。说明NF-κB在肿瘤组织中表达，但是姜黄素组（A组和C组）可显著抑制NF-κB的表达，姜黄素对SP亚群细胞荷瘤组的抑制作用最明显，与NONSP亚群细胞荷瘤组比较差异具有统计学意义。结果见表3、图2。

表3　各组小鼠肿瘤组织NF-κB图像分析结果（±s）Tab.3 NF-κB image analysis results in tumor tissue of each group（±s）

注：A组与B、D两组比较，**P＜0.01；A组与C组比较，*P＜0.05；B、D两组比较，△P＞0.05。

组别动物数NF-κB的表达A组1094.1±4.21 B组10145.2±3.87** C组10113.6±4.32* D组10136.4±5.17**

3.4各组小鼠肿瘤组织中Notch-1mRNA的表达经PCR分析后显示，结果处理如下：ΔCt=Ct（Survivin）-Ct（β-actin）；ΔΔCt=空白对照组ΔCt-各观察组ΔCt；Ratio值=2ΔΔCt。结果显示，A组Notch-1 mRNA的表达低于其他各组，且与C组比较，差异具有统计学意义，B、D两组高于A、C两组，差异具有显著性。同样证明，姜黄素可抑制Notch-1 mRNA的表达，并且姜黄素对SP细胞荷瘤裸小鼠肿瘤组织Notch-1 mRNA的抑制作用优于NON-SP细胞荷瘤裸小鼠。结果见表4。

图1　各组肿瘤组织VEGF染色结果Fig.1 VEGF dye results in tumor tissue of each group

图2　各组肿瘤组织NF-κB染色结果Fig.2 NF-κB dye results in tumor tissue of each group

表4　各组小鼠肿瘤组织中Notch-1 mRNA的表达（±s）Tab.4Notch-1 mRNA expression in tumor tissue of each group（±s）

表4　各组小鼠肿瘤组织中Notch-1 mRNA的表达（±s）Tab.4Notch-1 mRNA expression in tumor tissue of each group（±s）

注：A组与B、D两组比较，**P＜0.01；A组与C组比较，*P＜0.05；B、D两组比较，*P＜0.05。

组别动物数Ratio值A组1017.46±2.86** B组1039.43±3.21 C组1020.12±4.66* D组1043.22±3.60*

4　讨论

肿瘤血管生成及侵袭是肿瘤生长和转移的必要条件。VEGF是一种高效、特异性地作用于血管内皮细胞的生长因子，对血管内皮细胞具有强烈的促分化作用。它是一种高度特异性的有丝分裂原，能直接刺激新生血管的形成；被公认为是最重要和最强的促血管生成因子［3］。VEGF是诱导和促进血管生成最强有力的关键因子，也是抗血管生成的重要靶点；肿瘤组织往往过量表达VEGF因子，该因子可以与血管内皮细胞表面VEGF受体特异性结合，活化其包内酪氨酸激酶，并最终促进血管内皮细胞增殖和游走，构成血管样结构［4］。

Notch信号通路是保守的受体配体信号通路，在细胞的增殖、凋亡和分化中起重要作用，影响多个器官的发育和功能。在不同组织起源的肿瘤中，或同种肿瘤的不同阶段，Notch信号通路发挥抑制或促进肿瘤的作用。对于绝大多数人类肿瘤来说，Notch信号通路起促癌作用。Notch信号通路的活性与肿瘤患者生存率密切相关，并且可以作为判断肿瘤患者预后的一个指标。近年来，对肺癌发病机制的研究发现［5-7］，不同类型肺癌有不同Notch组分表达。在非小细胞肺癌细胞中，Notch1、Notch3、HES-1表达很常见。有学者证实［8］，Notch1在成人肺腺癌、鳞癌中高表达，在小细胞肺癌中低表达。Sriuranpong等［9］证实Notch1、Notch2的过量表达使SCLC细胞周期阻滞在G1期，抑制细胞生长。由此推断Notch信号通路与肺癌的发病有密切关系，在不同类型肺癌中表现促癌或抑癌作用。姜昕等［10］检测到在NSCLC中Notch1、HIF-1、VEGF及Notch1 mRNA表达均上调，提示其在肺癌的发生、发展中可能起重要作用，并认为检测Notch1蛋白及mRNA可作为肿瘤侵袭及转移的转移指标。此外，Notch信号通路可以影响其他细胞信号通路的活性，如NF-κB、Akt、mTOR、Ras、Wnt、EGFR、PDGF等［11-15］，在肿瘤的进展中发挥重要作用，是一个非常复杂的信号通路［16-17］。Donnem等［18］认为在NSCLC中Notch1与VEGFA共表达提示预后差。实验发现，肺腺癌A549 SP细胞亚群荷瘤模型组小鼠瘤体与NON-SP细胞亚群荷瘤模型组小鼠相比体积较大；姜黄素可以抑制肿瘤生长［19］，并可以降低VEGF的表达，抑制NF-kB的表达，通过RT-PCR检测出其可下调Notch1 mRNA含量，对肿瘤血管的生成有一定的抑制作用。同时研究发现，SP亚群细胞姜黄素组抑瘤作用及抗肿瘤血管生成优于NON-SP亚群细胞姜黄素组，说明姜黄素能够通过某种途径阻断Notch信号转导通路，下调该通路的关键表达因子Notch-1和调节因子NF-κB的表达，抑制了肿瘤细胞的生成长。

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（本文编辑：马英，滕晓东）

Curcumin extract influence on tumor angiogenesis of A549 cell subsets SP and NON-SP cells

LI Xiao-jiang1，JIA Ying-jie1，ZHANG Wen-zhi2，ZHANG Ying1，XU Wen-ting3
（1．The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tianjin Neurosurgery Institute，Tianjin 300060，China；3.Graduate School，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］Through the animal experiment further understand the main ingredient in turmeric extract curcumin-of tumor angiogenesis of the specific mechanism.［Methods］The 40 BALB/C mice were divided into four groups of male nude，one group is only 10.group A（SP and group of cells curcumin group），group B（SP and group of cells tumor-burdened control group），group C（as SP and group of cells curcumin group），group D（as SP and group of cells tumor-burdened control group）.A and B two groups in lung adenocarcinoma before the establishment A549SP cells subsets tumor-burdened model，C，D two groups establish lung adenocarcinoma A549 cells subsets as SP tumor-burdened model，and after 16 days the model are observated，in group A，C intraperitoneal injection of mice curcumin，the next day 1，eight times，B and D two groups of injection saline.16 days later executed mice，will tumor piece of tissue dissection，comparison of the heavy；immunohistochemical method to detect tumor tissue VEGF，CD34，NF-kB expression；PT-PCR detected Notch1 mRNA content.［Results］The group of cells SP curcumin group of suppression effect was better than the group of cells as SP curcumin group that cancer stem cells and tumor angiogenesis closely related.［Conclusion］Curcumin can inhibit tumor growth，and may inhibit the expression of NF-kB，down regulate the content of mRNA Notch，block the Notch1 signaling pathway and inhibit the expression of VEGF in tumor tissues.

curcumin；VEGF；NF-κB；human lung adenocarcinoma A549；NON-SP cell；SP cell

R73-3

A

1672-1519（2016）03-0164-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.03.10

国家自然科学基金资助项目（81001578）；抗癌重大专项攻关计划（12ZCDZSY15800）；天津市应用基础与前沿技术研究计划重点项目（14JCZDJC36900）。

李小江（1980-），女，博士，副主任医师，主要从事肿瘤学研究。

（2015-09-25）