氢化胡椒碱对光甘草定软膏透皮渗透性的影响*

王　艳，叶柳青，刘园园，韩宛盈，王丽峰，宋春敬，张艳军（天津中医药大学中药学院，天津300193）

氢化胡椒碱对光甘草定软膏透皮渗透性的影响*

王艳，叶柳青，刘园园，韩宛盈，王丽峰，宋春敬，张艳军
（天津中医药大学中药学院，天津300193）

［目的］研究氢化胡椒碱对光甘草定软膏体外透皮作用的影响。［方法］通过改良Franz垂直扩散池考察光甘草定的透皮吸收性能，以高效液相色谱法测定光甘草定含量，以考察氢化胡椒碱、氮酮、冰片对光甘草定透皮吸收的影响。［结果］不同促渗剂对光甘草定累积透过量顺序为0.04%氢化胡椒碱组＞0.03%氢化胡椒碱组＞0.02%氢化胡椒碱组＞5%氮酮组＞3%氮酮组＞2%冰片组＞单体组，0.04%氢化胡椒碱组的24 h的累积渗透量最大，为26.51 μg/cm2，其促渗速率的增渗倍数最大，较单体组提高了5.03倍。［结论］不同的促渗剂对光甘草定均有促渗作用，并且0.04%氢化胡椒碱为透皮促渗剂对光甘草定体外透皮吸收效果最佳，可促进光甘草定快速有效的渗透。

光甘草定；促渗剂；透皮吸收；氢化胡椒碱

光甘草定（Glabridin）是一种中等极性的异黄酮类化合物，目前仅在光果甘草（Glycyrrhiza glabral）中被发现，其具有广泛的生物活性，特别是对酪氨酸酶具有非常强的抑制作用，是目前已知的作用最强的天然化合物之一［1-2］，同时，光甘草定还具有清除自由基的作用［1，3］。含量40%的光甘草定提取物被国际化妆品界誉为“美白黄金”，作为强效美白、祛斑的天然活性成分，已被广泛添加到高端护肤化妆产品中。因光甘草定对酪氨酸酶表现出的超强抑制作用，其被列为治疗色素沉着性皮肤疾病的候选药物［4］。

氢化胡椒碱（Tetrahydropiperine），又名四氢胡椒碱，简称THP，为类白色晶状粉末。除具有抗惊厥、抗癫痫、镇痛、抗蝇虫作用外，还具有协助促进所需有效成分在皮肤和组织中的渗透吸收的作用［5］。其和传统促渗剂氮酮（Azone）相比，全天然、量少高效和无刺激的优点尤为突出，因而在药品及化妆品行业得到广泛应用［6］。极少的添加量（0.01%～0.1%）即能发挥高效促进皮肤对有效成分的吸收和利用的功效。目前推测氢化胡椒碱的促渗机制为：1）改善脂质双层的流动性，促进有效成分分子在脂质双层的扩散。2）增强细胞膜对有效成分的亲和能力，从而达到促渗的效果［7］。

笔者之前的研究发现光甘草定的经皮吸收效果并不理想，需要通过添加促渗剂或高分子材料对光甘草定进行包含来提高其经皮渗透的效果［6-7］。氢化胡椒碱作为一个优良的促渗剂已在化妆品领域广泛应用，有关氢化胡椒碱对光甘草定的经皮吸收的作用的影响，国内外鲜有报道。本研究以现代经皮吸收给药为理论依据，以光甘草定为透皮吸收模型，考察氢化胡椒碱对光甘草定体外经皮吸收的影响，以及氢化胡椒碱的促渗作用与常见的几种促渗剂，如氮酮、冰片的促渗作用的比较。

1　仪器与材料

KQ-300 B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），FA 1004型万分之一分析天平（上海精科天平），HH-2型数显恒温水浴锅（河南石予华仪器有限公司），TB-P6型改良Franz透皮扩散试验仪（上海谐凯科技贸易有限公司），岛津LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）。

光甘草定提取物（纯度为91%，陕西帕尼尔生物科技有限公司），光甘草定对照品（质量分数98%以上，天津一方科技有限公司，批号：AZ71G001），乙腈、甲醇、乙醇、冰乙酸、三乙醇胺（天津市康科德科技有限公司），甘油、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、冰片、水溶氮酮、氢化胡椒碱（陕西慈源生物技术有限公司），娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈公司），生理盐水实验室自制。

昆明种实验小鼠，体质量（20±3）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司（动物合格证号：SIXK京2009-0004）。

2　方法与结果

2.1光甘草定的测定

2.1.1色谱条件HypersilODS色谱柱（5μm，4.6mm× 200 mm），乙腈-水-冰乙酸（55∶44∶1）为流动相，检测波长为280 nm，流速为1 mL/min，进样量为10 μL。

2.1.2对照品溶液制备称取光甘草定对照品适量，精密称定，置棕色量瓶内，用体积分数比为55%的乙腈-水溶液溶解并稀释定容至刻度，制备得到浓度为48.4 mg/L的光甘草定对照品储备液。

2.1.3专属性实验按“2.2.2”项下方法制备光甘草定的阴性软膏，并按“2.2.4”项下方法制备光甘草定阴性软膏的透皮接收液（A）；光甘草定对照品溶液（B）；按“2.2.2”项下方法制备光甘草定软膏，并按“2.2.4”项下方法制备光甘草定软膏的透皮接收液（C）。上述3种溶液分别用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，按“2.1.1”项下方法注入高效液相（HPLC）色谱仪测定，HPLC图谱见图1。由结果可知，软膏中的辅料和空白透皮液等对光甘草定的测定没有干扰。

图1　空白软膏透皮吸收液（A）、光甘草定对照品溶液（B）、光甘草定软膏透皮接受液（C）的HPLC图Fig.1HPLC chromatograms of blank ointment sample solution（A），Glabridin reference substances solution（B），transdermal solution after application of Glabridin（C）

2.1.4线性关系考察等比例量递减量取光甘草定对照品储备液置棕色量瓶内，用体积分数比为55%的乙腈-水溶液稀释定容至刻度，分别制备得到浓度为9.68、4.84、2.42、1.21和0.605 mg/L的对照品溶液。分别取上述对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪测定，HPLC谱图见图1。以光甘草定对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得回归方程=25 982X+22 176，r= 0.999 4，光甘草定在0.605～9.68 mg/L峰面积与进样质量浓度线性关系良好。

2.1.5精密度实验取同一对照品溶液，按“2.1.1”项下方法注入高效液相色谱仪测定，连续6次，记录峰面积积分值，并连续6 d分别测定，记录峰面积积分值，RSD分别为0.20%和1.84%，结果表明日内和日间精密度良好。

2.1.6重复性实验取同一时间点的6个不同接收池中的接收液，按“2.1.1”项下方法注入HPLC色谱仪测定，记录峰面积积分值，RSD为1.57%，表明重复性良好。

2.1.7稳定性实验取光甘草定对照品溶液，分别于0、2、4、6、8、10和24 h按“2.1.1”项下方法注入HPLC色谱仪测定，记录峰面积积分值，RSD为0.73%，表明光甘草定在24 h内稳定。

2.1.8回收率实验分别在已知质量浓度的高、中、低3种接收液中加入高、中、低3种质量浓度的光甘草定对照品溶液，每种质量浓度的样品平行取3份，测定质量浓度，计算回收率，结果光甘草定低、中、高质量浓度的加样回收率分别为103.81%、103.67%、101.21%，RSD分别为0.54%、0.19%、0.43%，表明回收率良好。

2.2体外透皮实验

2.2.1离体鼠皮的制备取小鼠，电动剃须刀刮去鼠毛，8%的硫化钠水溶液脱去残留的毛，处死，取下腹部皮肤，除去脂肪和皮下组织，置生理盐水中于4℃冰箱中备用［6-7］。

2.2.2光甘草定软膏的制备精密称取7份光甘草定（5 mg），分别加入三乙醇胺（0.5 g）和甘油（1.5 g）作为水相，硬脂酸（1.8 g）和单硬脂酸甘油酯（0.1 g）作为油相，其中1份加入处方比例2%的冰片，两份分别加入处方比例3%和5%的氮酮，其余3份分别加入0.02%、0.03%和0.04%的氢化胡椒碱，制备含有不同促渗剂的光甘草定软膏，见表1。不加样品及促渗剂的为空白软膏［8］。

2.2.3实验方法将处理好的鼠皮角质层向上固定于Franz扩散池上，在接收池各加入7.5 mL 30%乙醇-生理盐水，放置于恒温水浴的智能透皮试验仪中，37℃，200 r/min。平衡1 h，排尽接收池内的气泡后给药。扩散池供给面积上均匀涂上0.5 g光甘草定软膏，每组平行3次，分别在1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h和24.0 h时间点取接收液1 mL，同时补充同等体积的接收液，将吸取的接收液经0.45 μm的微孔滤膜过滤，按“2.1.1”项下方法进行分析［6-7］。

2.2.4供试样品的制备及测定取“2.2.3”项下的样品，按“2.1.1”项下方法注入高效液相色谱仪测定，记录峰面积积分值，计算光甘草定的质量，代入公式（1）计算累积透过量（Qn，μg/cm2）。

Cn：第n个时间点吸取液的浓度（mg/L）；Ci：第n-i个时间点吸取液的浓度（mg/L）；V：接收液的总体积即7.5 mL；Vi：每次吸取的液体体积即1 mL；A：接收池的体积即3.141 6 cm2。

2.2.5数据计算及结果

2.2.5.1经皮吸收曲线以Qn（μg/cm2）值为纵坐标，时间t（h）值为横坐标，绘制光甘草定经皮渗透曲线。选取包括零级动力学、一级动力学和Higuchi方程等在内的动力学模型，对实验结果进行拟合，对拟合度R2进行比较，确定最佳的释放药动学模型，计算透皮速率［J，μg/（cm2·h）］。

对数学模型拟合结果R2进行分析可知，光甘草定体外透皮释放符合零级动力学模型。将Qn对t进行零级动力学方程拟合，各实验组的体外透皮方程和相关参数见表2。

2.2.5.2稳态渗透速率［6-7］以累积渗透量Qn对时间t（h）作图，药物渗透达稳态后，直线部分斜率为透皮速率，即稳态渗透速率（Jss）；药物渗透系数（Kp）通过公式（2）计算。增渗倍数（ER），通过公式（3）计算。

表1　光甘草定软膏处方表Tab.1The prescription of Glabridin ointments g

表2　不同促渗剂对光甘草定软膏透皮特性的影响Tab.2Regression equations and related parameters on different penetration enhancers

C：接收池中药物浓度；Kp：加入促渗剂后光甘草定的渗透系数；Kp0：光甘草定固有的渗透系数。

2.2.6促渗剂对光甘草定透皮特性的影响将“2.2.2”项下制备的光甘草定，按“2.2.3”项下方法进行试验，再按“2.2.4”项下方法分别测定不同样品中光甘草定的含量，计算24h的光甘草定累积透过量Qn。

透皮吸收实验结果表明：含促渗剂的光甘草定软膏24 h Qn值均大于单体组，且差异有显著性（P＜0.01）。对影响显著的因素再进行两两比较后，得到结果：各含促渗剂的光甘草定软膏的促渗作用由强到弱为：0.04%氢化胡椒碱＞0.03%氢化胡椒碱＞0.02%氢化胡椒碱组、5%氮酮组＞3%氮酮组＞2%冰片组。其中0.04%氢化胡椒碱的24 h的累积渗透量最大，为26.51 μg/cm2。不同促渗剂软膏的光甘草定体外经皮吸收曲线，见图2。

图2　不同促渗剂的时间-累积透过量曲线Fig.2Profile of accumulative permeation amount of drugtime on different formulations

3　讨论

光甘草定几乎不溶于水或生理盐水中。因此在进行体外透皮吸收实验研究时，需要在生理盐水中加入适量的有机溶剂，如丙二醇、乙醇或聚乙二醇等［8］。已有的研究发现［8-9］，光甘草定在30%乙醇-生理盐水中溶解度最佳，所以本实验采用30%乙醇-生理盐水作为光甘草定体外透皮吸收实验的接收液。

渗透剂可以较为显著的影响药物的透皮渗透效果，其可改变皮肤角质层扁平细胞的有序叠集结构，使细胞从有序排列变成无序排列，角质层细胞间隙的空隙得以增大，最终可使药物迅速进入皮内而被吸收［10-11］。本实验中选取的氢化胡椒碱、氮酮和冰片是化妆品行业中常用促渗剂，冰片可通过改变角质层中脂质分子的排列和增加其流动性以达到促渗的效果［12］；氢化胡椒碱可通过增加脂质双层的流动性，促进药物分子和活性物分子扩散通过脂质双层的碳氢化合物部位；增加药物分子和营养物质与细胞膜的亲和能力以达到促渗的效果；氮酮可通过改变脂质双分子层的致密性和增加脂质的流动性以达到促渗的效果，且对细胞内的蛋白质无作用，毒性及刺激性小［13］。三者有相似的促渗透作用机制。

本实验结果表明，这些促渗剂对光甘草定的体外经皮吸收均具有明显的促进作用，其中氢化胡椒碱促渗效果最明显。氢化胡椒碱是全天然，无刺激，用量少且促渗作用高效迅速的一种天然促渗剂，在化妆品行业有广泛的应用，0.01～0.1%的添加量即能改善和促进皮肤对有效成分的吸收和利用。但关于氢化胡椒碱的促渗作用的研究却少见报道。文章对氢化胡椒碱对光甘草定的促渗作用做了初步研究，发现氢化胡椒碱在添加量仅为0.04%的条件下，24 h内累计透过率可到达33.32%。比相同条件下，添加量分别为5%氮酮组和2%冰片的促渗效果更显著。同时，根据实验结果，对光甘草定的促渗效果为0.04%氢化胡椒碱＞0.03%氢化胡椒碱＞0.02%氢化胡椒碱，随氢化胡椒碱含量的增大，促渗效果也随之增强。课题组将会在此研究基础之上，对氢化胡椒碱的最佳添加量及氢化胡椒碱的作用机制作进一步深入探究。

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（本文编辑：高杉，滕晓东）

Influence of Tetrahydropiperine on transdermal permeation of Glabridin in ointment

WANG Yan，YE Liu-qing，LIU Yuan-yuan，HAN Wan-ying，WANG Li-feng，SONg Chun-jing，ZHANG Yan-jun
（School of Chinese Materia Medica，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To investigate the effect of Tetrahydropiperine on transdermal of Glabridin in ointment.［Methods］Franz vertical diffusion cell was adopted to investigate transdermal performance of glabridin and observe the effect of Tetrahydropiperine（THP），azone，borneol on transdermal permeation of Glabridin.［Results］Effect of enhancers on Glabridin was ranked as follows:0.04%THP＞0.03% THP＞0.02%THP＞5%azone＞3%azone＞2%borneol.When the content of THP was 0.04%，the cumulative permeation of Glabridin was the highest，up to 26.51 μg/cm2.The penetration rate amount with 0.04%THP was 5.03 times than which no permeation enhancer.［Conclusion］These different permeation enhancer have the effect of Glabridin，Glabridin can be permeated quickly and efficiently.

Glabridin；penetration enhancers；transdermal；Tetrahydropiperine

R285.5

A

1672-1519（2016）03-0177-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.03.13

西青区科技型中小企业发展专项资金项目（XQKH2013-011）；天津中医药大学第四届大学生科技创新基金项目（CXJJ2013ALL）。

王艳（1977-），女，硕士，天津中医药大学，讲师，研究方向为中药新药开发和中药化妆品开发。

张艳军，E-mail：zyjsunye@163.com。

（2015-09-16）