海藻酸钠凝胶黏膜下注射黏膜隆起效果的实验研究*

温春虹，闵培，邱晓莉，李佩，刘妍，刘将，唐庆林，苏军凯，张鸣青［中国人民解放军第一七五医院 消化内科（南京军区消化内镜诊疗中心），福建 漳州 363000］

论 著

海藻酸钠凝胶黏膜下注射黏膜隆起效果的实验研究*

温春虹，闵培，邱晓莉，李佩，刘妍，刘将，唐庆林，苏军凯，张鸣青
［中国人民解放军第一七五医院 消化内科（南京军区消化内镜诊疗中心），福建 漳州 363000］

目的 以生理盐水（NS）为对照，评估不同浓度的海藻酸钠（SA）溶液作为黏膜下注射液，用于内镜黏膜下剥离术（ESD）的可行性及优越性。方法 ①在新鲜离体猪食管及猪胃的黏膜下，注入不同浓度的SA溶液及NS溶液，观察并测量各注射液所致黏膜隆起高度，及此高度随时间的变化情况；②在活体小猪的胃黏膜下注射SA溶液后，模拟进行ESD手术，观察SA溶液对ESD术的辅助作用。结果 离体猪食管、胃实验中，注射相同体积SA溶液的实验组所致黏膜隆起高度明显高于注射NS的对照组。其中，食管黏膜下注射1% SA溶液与注射NS相比，差异有统计学意义（P ＜0.01）；胃黏膜下注射3% SA溶液维持黏膜隆起高度与注射NS相比，差异有统计学意义（P ＜0.001）。活体小猪胃模拟ESD术的实验中，注射SA溶液可以明显地分离组织、隆起黏膜，且形成稳定的凝胶垫，促进术中快速剥离黏膜的同时保护下层组织。结论 黏膜下注射SA溶液可以持久地维持黏膜隆起高度，有利于黏膜组织的剥离切除，且由于其黏性，可较好地在黏膜下形成保护屏障，并对创面起到一定的压迫止血作用，可减少ESD术中穿孔、出血等并发症的出现。因此，SA是可用于临床的较为理想的黏膜下注射液。

内镜黏膜下剥离术；黏膜下注射液；海藻酸钠

海藻酸钠（sodium alginate，SA）是从海带、巨藻等褐藻中提取的一种天然高分子多糖类化合物，因具有良好的增稠性、成膜性、稳定性和生物相容性，且无毒性，而广泛应用于食品、医药等行业［1］。它是由β-D甘露糖醛酸（M单元）和α-L古洛糖醛酸（G单元）按照（1→4）糖苷键以不同顺序、单元共价连接的线型聚合物。不同比例的n（M）/n（G）的SA，其黏度、凝胶化性能等有较大的差异。

内镜 黏膜下剥离术（endoscopic submucosal dissection，ESD）可整块切除黏膜及黏膜下病变，提供完整的病理标本，是消化道早期癌和肿瘤的首选治疗方法。ESD切除病变范围较大，操作时间较长，出血和穿孔是术中常见并发症［2-3］。通过合适的黏膜下注射液，使黏膜充分隆起并形成黏膜下液垫，保护肌层组织，可减少ESD术中并发症的发生。本研究以生理盐水（normal saline，NS）为对照，初步探讨SA溶液是否能在ESD术中维持黏膜隆起，减少出血、穿孔等并发症，成为有效的ESD术黏膜下注射液。

1　材料及方法

1.1材料与试剂

1.1.1实验材料新鲜离体猪食管与猪胃各6个，购自超市，待用时于4℃冰箱保存，实验时间距离猪屠宰时间不超过12 h。实验猪一只（由中国人民解放军第一七五医院实验动物中心提供），体重15 kg，术前禁食12 h以上。

1.1.2实验用药SA粉剂（湖北葛店人福药用辅料有限责任公司），用无菌注射用水配制成浓度分别为1%、2%和3%的SA溶液100 ml，存于4℃冰箱备用。

1.2器械

实验台、动物手术器械包，注射器，计时器，大头针，丝线，照相机，直尺，白色泡沫板，以上器械均由第一七五医院动物实验中心提供。胃镜采用

Olympus GIF-H260Z电子胃镜，Olympus公司23G、25G（Gauge，后文亦简称G）注射针，Olympus KD-611L IT刀。

1.3方法

1.3.1离体组织黏膜下注射溶液实验用大头针将猪食管、猪胃固定在方形泡沫板上（图1），黏膜下注射1%、2%和3%的SA溶液及NS溶液4组液体各1 ml，猪食管、胃黏膜下立即形成隆起，用直尺联合丝线测量各组隆起的高度（0 min），并用数码相机垂直于食管、胃所在平面拍照，准确记录各组黏膜隆起的高度；5、15、30和60 min后分别再在同一位置测量隆起高度，同时用数码相机拍照进行记录。独立重复猪食管、猪胃黏膜下注射实验各6次。

图1　离体实验模型

1.3.2活体小猪模拟ESD实验术前禁食12 h以上，用“速眠新”以0.2 ml/kg剂量肌肉注射，待小猪麻醉稳定后，左侧卧位固定。经口插入法与普通胃镜类似，模拟进行ESD术。由于动物口腔的特异性，采用特定的牙垫，既固定小猪嘴巴防止咬坏胃镜而又保证胃镜视野清晰。配制好不同浓度的SA溶液及NS溶液，用内镜注射针分别从胃镜钳道注入胃窦黏膜下。观察注射SA溶液后胃黏膜隆起的高度及持续时间。随后用IT刀进行ESD术，观察黏膜下注射SA溶液是否发生出血、穿孔等并发症情况。

1.4统计学方法

黏膜隆起高度变化采用GraphPad Prism 6软件的Two-way ANOVA Multiple comparisons进行统计学分析，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1离体实验黏膜隆起高度变化

2.1.1食管在新鲜离体猪食管黏膜下注射不同浓度的SA及NS溶液后，黏膜隆起的形态及隆起高度随着时间推移的变化情况如图2和3所示。注射1 ml 1% SA、2% SA、3% SA溶液及NS溶液后黏膜的初始（0 min）隆起高度分别为（5.63±0.56）、（4.97±0.64）、（4.84±0.53）和（4.03±0.70）mm；60 min后，1% SA、2% SA、3% SA溶液及NS溶液所致黏膜隆起高度分别变化为（4.51±0.75）、（4.00±0.66）、（4.41±0.46）和（2.93±0.91）mm。如图3所示，注射SA溶液后黏膜隆起明显高于注射NS，且此隆起高度变化缓慢、稳定，即与注射NS相比，注射SA溶液所维持的黏膜隆起更为持久。其中，1%SA溶液与NS相比，差异有统计学意义（P ＜0.01）。

图2　不同注射液所致猪食管黏膜隆起形态随时间推移的变化

图3　不同注射液所致猪食管黏膜隆起高度随时间推移的变化

2.1.2胃在新鲜猪胃黏膜下，注射不同浓度的SA 及NS溶液后，黏膜隆起的形态及隆起高度随着时间推移的变化情况如图4和5。注射1 ml 1% SA、2% SA、3% SA溶液及NS溶液后黏膜的初始（0 min）隆起高度分别为（4.64±0.94）、（4.38±0.32）、（4.86±0.49）和（4.28±0.32）mm；60 min后，1% SA、2% SA、3% SA溶液及NS溶液所致黏膜隆起高度分别变化为（4.10±0.63）、（3.92±0.31）、（4.51±0.58）和（2.83±0.42）mm。如图5所示，注射SA溶液组所致胃黏膜隆起明显高于注射NS组，且黏膜隆起高度变化趋势平稳。相比较而言，注射NS组所致黏膜隆起高度随时间推移明显降低，而SA溶液组直至60 mins尚保持在较高的水平。其中，3% SA溶液与NS相比，差异有统计学意义（P ＜0.001）。

2.2活体小猪模拟ESD术

SA注射液呈较稀的凝胶状，其黏度随浓度增大而增高。操作中发现，1%、2%和3%的SA溶液均可通过23G、25G内镜注射针在活体猪胃黏膜下注射，但需较大的力气。经我科3名内镜室护士反复评估，应用23G针注射1%SA溶液或25G针注射0.6%SA溶液为较易进行的配合操作。

图4　不同注射液所致猪胃黏膜隆起形态随时间推移的变化

图5　不同注射液所致猪胃黏膜隆起高度及其随时间推移的变化

内镜注射针从胃镜钳道内将各组溶液注入胃窦黏膜下，可以看到不同高度的黏膜隆起。由图6A可见，注射SA溶液所致黏膜隆起边界清晰，有效地分离了黏膜与黏膜下层组织，且其可持久维持黏膜隆起，为使用IT刀稳定、准确操作ESD手术提供便利。模拟ESD术剥离后，可见完整的SA覆盖住黏膜下层（图6B），取出SA可见光滑的黏膜下层（图6C）。由此可见，注射SA溶液所形成的隆起，因其黏性形成较稳定的黏膜下液垫，可降低ESD术中穿孔的发生率。同时，凝胶状的SA溶液对切除创面具有一定的压迫作用，也可降低术中出血的发生率（图6B和C示ESD切除边缘创面较为整齐、无出血）。

图6　活体小猪的ESD手术

3　讨论

ESD术因其“微创”且疗效可靠而广泛应用于黏膜肿瘤组织的切除，尤其是较大病灶的切除。应用有效的黏膜下注射液可减少ESD术中穿孔、出血等并发症的发生。

普遍认为，理想的黏膜下注射液具有以下特点：①能使病变部位充分隆起；②黏膜下隆起持续时间长；③价格合理；④对周围组织无损伤；⑤易获取、储存及注射等。近年来，葡萄糖溶液、甘油果糖溶液、壳聚糖水凝胶［4］、自体血［5］、羟丙甲纤维素［6］和透明质酸钠溶液等［7］作为黏膜下注射液的可行性及安全性方面的研究报道及黏膜下注射液的Meta分析报道［8］时有更新。但这些注射剂大多存在价格昂贵、不易储存、注射困难或副作用明显等缺点。如温敏凝胶PLGAPEG-PLGA，常温下呈液态，人体体温时转变为固状凝胶，是作为黏膜下注射液的优良选择，研究报道也显示它具有良好的黏膜隆起效果及很好的生物相容性［9］。但是，其制备方法较为复杂，直接购买原料价格又较高（SIGMA：5 087.16元/g），目前并未广泛用于临床。

目前，国内临床上常用的黏膜下注射液主要是NS溶液，但因它是等渗溶液，注射后液体向周围组织扩散快，易被吸收，黏膜隆起持续时间较短，需要多次注射维持隆起［10］，造成操作时间延长、穿孔等并发症发生率较高。寻找其他辅助ESD效果佳、易推广使用的黏膜下注射液，可进一步促进ESD在消化道疾病微创治疗中的应用。

AKAGI等［11］在动物实验中分析了SA作为黏膜下注射液的有效性，后进行11例黏膜下注射SA的临床试验，成功切除早期胃癌病灶，且无并发症发生，随访结果显示无再复发。KUSANO等［12］进一步研究发现，SA溶液对组织无损害，0.6%的SA溶液在临床使用中具有很好的黏膜隆起效果。

目前，国内尚未有SA作为黏膜下注射液的相关报道，本研究旨在通过实验，探讨廉价易得、制备方便的SA溶液作为ESD黏膜下注射液的可行性及有效性，为推广其临床使用提供数据支撑。在本研究中，通过与注射NS对比，注射SA溶液所致黏膜隆起呈现更高更持久的趋势。注射SA组隆起组织的界限清晰，这可加快ESD整块切除的术程。SA的凝胶状形态产生局部压迫作用，可减少术中出血的发生率。另因其凝胶特性形成的黏膜下液垫对下层组织有很好的保护作用，可减少穿孔的发生率。本研究不足之处在于：①离体实验中，在猪食管注射3% SA溶液后有细微渗出，导致黏膜隆起高度有所影响；同样，在猪胃离体实验中，注射2% SA溶液也有细微渗出，因而黏膜隆起高度也有所打折；②活体实验中，黏膜下注射SA溶液辅助进行ESD术，术程顺利，但未记录黏膜持续隆起的时间，并未与NS组比较分析；对上文提到的隆起边界清晰的优势，降低穿孔和出血率等优势，没有记录明确的统计数据加以说明。

离体实验中的渗出可能与实验操作有关，也可能由于随着浓度的增加，SA凝胶溶液的张力增强，从而易从注射针眼中溢出。因此，下一步实验将选取合适的SA浓度，在活体小猪中，分析它的黏膜隆起效果，对ESD操作时间的影响，并评估可它的止血性能、组织相容性及在黏膜下存留时间等。

致谢：本研究得到四川大学生物治疗国家重点实验室钱志勇教授的指导，以及惠赠PEG-PCL-PEG纳米温敏凝胶用于本课题黏膜下注射液试剂筛选。

［1］ 王春霞， 张娟娟， 王晓梅， 等. 海藻酸钠的综合应用进展［J］. 食品与发酵科技， 2013， 49（5）: 99-102.

［2］ TOYOKAWA T， INABA T， OMOTE S， et al. Risk factors for perforation and delayed bleeding associated with endoscopic submucosal dissection for early gastric neoplasms: Analysis of 1123 lesions［J］. Journal of Gastroenterology and Hepatology，2012， 27（5）: 907-912.

［3］ ODA I， SUZUKI H， NONAKA S， et al. Complications of gastric endoscopic submucosal dissection［J］. Digestive Endoscopy， 2013，25（Suppl 1）: 71-78.

［4］ KUMANO I， ISHIHARA M， NAKAMURA S， et al. Endoscopic submucosal dissection for pig esophagus by using photocrosslinkable chitosan hydrogel as submucosal fluid cushion［J］. Gastrointestinal Endoscopy， 2012， 75（4）: 841-848.

［5］ WEN W， SHI C， SHI Y， et al. A pilot animal and clinical study of autologous blood solution compared with normal saline for use as an endoscopic submucosal cushion［J］. Experimental and Therapeutic Medicine， 2012， 4（3）: 419-424.

［6］ ARANTES V， ALBUQUERQUE W， BENFICA E， et al. Submucosal injection of 0.4% hydroxypropyl methylcellulose facilitates endoscopic mucosal resection of early gastrointestinal tumors［J］. J Clin Gastroenterol， 2010， 44（9）: 615-619.

［7］ CHANDRASEKHARA V， SIGMON J C Jr， SURTI V C， et al. A novel gel provides durable submucosal cushion for endoscopic mucosal resection and endoscopic submucosal dissection［J］. Surgical Endoscopy， 2013， 27（8）: 3039-3042.

［8］ HUAI Z Y， FENG XIAN W， CHANG JIANG L， et al. Submucosal injection solution for endoscopic resection in gastrointestinaltract: a traditional and network meta-analysis［J］. Gastroenterology Research and Practice， 2015， 2015: 702768.

［9］ YU L， XU W， SHEN W， et al. Poly （lactic acid-co-glycolic acid）-poly（ethylene glycol）-poly（lactic acid-co-glycolic acid） thermogel as a novel submucosal cushion for endoscopic submucosal dissection［J］. Acta Biomaterialia， 2014， 10（3）: 1251-1258.

［10］ POLYMEROS D， KOTSALIDIS G， TRIANTAFYLLOU K， et al. Comparative performance of novel solutions for submucosal injection in porcine stomachs: An ex vivo study［J］. Digestive and Liver Disease， 2010， 42（3）: 226-229.

［11］ AKAGI T， YASUDA K， TAJIMA M， et al. Sodium alginate as an ideal submucosal injection material for endoscopic submucosal resection: preliminary experimental and clinical study［J］. Gastrointestinal Endoscopy， 2011， 74（5）: 1026-1032.

［12］ KUSANO T， ETOH T， AKAGI T， et al. Evaluation of 0.6% sodium alginate as a submucosal injection material in endoscopic submucosal dissection for early gastric cancer［J］. Digestive Endoscopy， 2014， 26（5）: 638-645.

（吴静 编辑）

Experimental study on the elevation effect of sodium alginate as a submucosal injection solution*

Chun-hong Wen， Pei Min， Xiao-li Qiu， Pei Li， Yan Liu， Jiang Liu，Qing-lin Tang， Jun-kai Su， Ming-qing Zhang
（Department of Gastroenterology， The 175th Hospital of PLA， Digestive Endoscopy Center of Nanjing Military Command， Zhangzhou， Fujian 363000， China）

Objective To evaluate the feasibilities and advantages of different concentrations of sodium alginate （SA） solutions as a submucosal injection solution for endoscopic submucosal dissection （ESD）. Methods In vitro study， different concentrations of sodium alginate solutions and normal saline were injected into submucosal of resected porcine esophagus and stomach respectively， then observe and measure the heights of each injection induced mucosal elevations， and their changes over time. In vivo study， the mimic ESD were conducted in healthy pigs to evaluate the mucosal elevation effect and other assistant effects of sodium alginate as a submucosal injection solution. Results The elevation heights of the experiment groups injected with SA solutions were much higher than the control group injected with normal saline. Specially， the elevation created by 1 % SA in porcine esophagus was signifi cantly higher than that of normal saline （P ＜ 0.01） and the elevation created by 3 % SA was signifi cantly higher than that of normal saline in porcine stomach （P ＜ 0.001）. In the mimic ESD experiment， mucosal elevation with clear marginoccurred immediately after injection with SA solution. And the durable submucosal fluid cushion created by SA protected deeper tissues while facilitating ESD procedure. Conclusion The elevation heights created by SA solutions were greater and more durable than that created by normal saline， which were crucial for ESD. The viscosity property enabled SA to form a stable protective cushion and prevent bleeding by squeezing tissue around the wound， which may decrease perforation and bleeding rate during ESD procedure. Therefore， sodium alginate can be an ideal clinical submucosal injection solution.

endoscopic submucosal dissection； submucosal injection solution； sodium alginate

R-332

A

10.3969/j.issn.1007-1989.2016.08.004

1007-1989（2016）08-0014-06

2016-04-01

南京军区医学科技创新重点项目（No：15ZD026）；南京军区创新资助项目（No：12MA066）；第一七五医院科技计划项目-青年苗圃（No：15Y005）

张鸣青，E-mail：zmqing8084@sina.com