对称性肢端角化病皮损中PrxI和CLASP1的表达

于作忠　程云龙　盛　萍　黎世杰　樊翌明

对称性肢端角化病皮损中PrxI和CLASP1的表达

于作忠#程云龙#盛萍黎世杰樊翌明

目的：检测对称性肢端角化病（SAK）皮损中过氧化物还原酶I（Prx I）和胞质链接相关蛋白1（CLASP1）的表达水平。方法：用RT-PCR和免疫组化方法检测9例SAK患者腕部皮损及其周围皮肤和9名正常人腕部皮肤中的Prx I和CLASP1 mRNA及蛋白质的表达。结果：SAK皮损中Prx I和CLASP1 mRNA水平为（0.94±0.66）和（0.95±0.76），明显高于皮损周围（0.51±0.20，0.56±0.31）和正常皮肤（0.45±0.26，0.47±0.33）。SAK皮损中Prx I阳性细胞弥漫分布于表皮基底层和棘层，而CLASP1阳性染色主要位于棘层，二者的阳性染色范围及程度明显高于皮损周围和正常人皮肤。结论： SAK皮损中Prx I和CLASP1表达上调，可能参与表皮角质形成细胞过度增殖和异常分化。

对称性肢端角化病； 过氧化物还原酶I； 胞质链接相关蛋白1

对称性肢端角化病（symmetrical acralkeratoderma，SAK）是我国学者于2008年首次报道并命名的皮肤病［1，2］。我们于2010年在国际上首次报道该病［3］，并总结了国内报道的138例临床特点［4］。SAK已被国际皮肤科学界认可是一种新的皮肤病［5］，其他国家未见报道。SAK病因及发病机制所知甚少。我们前期蛋白组学研究显示SAK皮损中过氧化物还原酶I（peroxiredoxin I，Prx I）、胞质链接相关蛋白1（cytoplasmic linker associated protein 1，CLASP1）表达上调。本研究拟用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫组化技术进一步验证Prx I和CLASP1在SAK皮损、皮损周围和正常人皮肤中表达情况。

1　资料与方法

1.1病例资料 我科门诊就诊的SAK患者9例，男8例，女1例，年龄20～37岁，平均年龄（25.67±5.94）岁。正常对照9名，男6名，女3名，年龄15～53岁，平均年龄（27.33±10.59）岁。腕部皮损及其周围皮肤、正常人腕部皮肤进行皮肤活检，一半用10%中性福尔马林固定，另一半用液氮保存。

1.2主要试剂 Trizol试剂、M-MLV逆转录试剂盒购自Life Technologies公司，鼠抗人CLASP1（D-8）、兔抗人Prx I（D5G12）单克隆抗体分别购自Santa Cruz公司、Cell Signaling Technology公司，即用型免疫组化EliVisionTMplus试剂盒（KIT-9902）、加强型DAB显色试剂盒（DAB-2031）购自福州迈新生物技术公司。1.3 RT-PCR 用Trizol试剂提取标本中总RNA，M -MLV逆转录试剂盒合成cDNA，-20℃保存备用。人Prx I、CLASP1和GAPDH引物序列采用Primer 3软件设计，由上海生工生物工程公司合成。Prx I上游引物5′-CAACTGCCAAGTGATTGGTG-3′，下游引物5′-TCCCCATGTTTGTCAGTG AA-3′；CLASP1上游引物5′-TGGATCTGTGCAAGCAAAAG-3′，下游引物5′-GGCAAGGCACC AAGTAACAT-3′。PCR反应体系为Premix Taq 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，加灭菌蒸馏水至20 μL。反应条件为:98℃预变性5 min；98℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35个循环；72℃延伸5 min。取10 μL扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，用UVP凝胶成像系统观察结果，计算Prx I、CLASP1与GAPDH mRNA灰度值比值。

1.4免疫组化检测 石蜡切片采用柠檬酸盐高温高压法修复抗原，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶；滴加一抗（Prx I、CLASP1工作浓度分别为1∶200、1∶400），4℃孵育过夜后室温孵育2 h；EliVisionTMplus试剂盒处理后DAB显色。用磷酸盐缓冲液替代一抗作为阴性对照。用DP71显微照相系统，每张切片随机选择10个不同视野（×400），观察染色范围及染色强度。染色范围指阳性染色细胞占各层细胞比例: 0%（-），1%～25%（+），26%～50%（2+），51%～75%（3+），＞75%～100%（4+）。染色强度指阳性染色颜色:阴性（-），淡黄色（+），棕黄色（2+），深棕色（3+），棕黑色（4+）。

1.5统计学方法 RT-PCR结果用-x±s表示。用SPSS 17.0统计软件分析数据，采用方差分析及LSD检验（方差齐）或Dunnett T3检验（方差不齐）。

2　结果

2.1RT-PCR检测Prx I、CLASP1 mRNA表达 PCR产物琼脂糖凝胶电泳显示GAPDH、Prx I、CLASP1扩增片段为目的基因片段，依次出现在323 bp、306 bp、342 bp处（图1）。SAK皮损中Prx I、CLASP1 mRNA表达均高于皮损周围及正常皮肤（P＜0.05）（图1，表1）。

图1　PCR扩增产物凝胶电泳显示SAK皮损中Prx I、CLASP1 mRNA表达明显高于皮损周围和正常皮肤

表1　SAK皮损、皮损周围及正常皮肤中Prx I、CLASP1 mRNA表达

2.2免疫组化检测Prx I、CLASP1蛋白表达 Prx I阳性表现为胞质内出现褐色颗粒。SAK皮损中，Prx I染色主要位于表皮基底层及棘层；皮损周围皮肤中，Prx I表达于棘层中下部及基底层；正常皮肤中，Prx I仅表达于基底层（图2，表2）。小汗腺导管、毛囊和皮脂腺阳性染色较弱（图2）。

CLASP1阳性表现为胞质染色。SAK皮损中CLASP1呈强阳性染色，主要集中于棘层，部分病例也有基底层和颗粒层着色；皮损周围及正常皮肤中，亦见棘层染色，但染色范围及染色强度明显弱于SAK皮损（图3，表3）。小汗腺导管可见阳性染色，而毛囊、皮脂腺着色较弱（图3）

表2　SAK皮损、皮损周围及正常皮肤中Prx I蛋白表达

图2　SAK皮损（a）、皮损周围皮肤（b）、正常皮肤（c）中Prx I免疫组化染色（×200）

图3　SAK皮损（a）、皮损周围皮肤（b）、正常皮肤（c）中CLASP1阳性（免疫组化染色，×200）

表3　SAK皮损、皮损周围及正常皮肤中CLASP1蛋白表达

3　讨论

哺乳动物中Prx家族有6个亚型，定位于胞质、胞核、线粒体、过氧化物酶体及内质网，其中Prx I含量最丰富［6］。人类Prx I基因定位在1p34.1，编码199个氨基酸的蛋白（分子量约为23 kD）；Prx I主要分布于胞质及线粒体、过氧化物酶体等细胞器，胞核亦有少量分布［7］。大鼠皮肤显示胞质Prx I染色从基底层到颗粒层呈增强趋势，毛囊外毛根鞘和皮脂腺也有表达［8］。本文结果发现人类与大鼠皮肤中Prx I表达模式存在较大差异。SAK皮损中Prx I表达明显高于皮损周围及正常皮肤。皮损中Prx I强阳性细胞弥漫分布于基底层及棘层，皮损周围皮肤中Prx I表达于棘层中下部及基底层，而正常皮肤中Prx I仅在基底层有弱阳性染色。

肝癌、肺癌、食管癌、膀胱癌等实体肿瘤和白血病中Prx I过表达［9］。Prx I蛋白既对紫外线诱导氧化损伤有保护作用，也抑制UVA诱导细胞凋亡和炎症反应；Prx I和Prx II在清除细胞代谢产生的过氧化氢过程中起重要作用，也参与细胞增殖、分化、NK细胞活性、氧化应激反应、成骨调节［10］。Prx I基因缺陷小鼠成纤维细胞增殖减少，对DNA氧化损伤的敏感性增加，提示Prx I是老年小鼠重要的抗氧化分子［11］。此外，我们同期的研究发现SAK皮损中Cullin 3表达增加，可能导致角质形成细胞对氧化应激的敏感性增加。因此，Prx I高表达可能通过清除细胞代谢产生的过氧化氢，减轻Cullin 3过表达所致的氧化应激反应，从而使病变皮肤达到暂时性内环境平衡；另一方面，Prx I高表达可能促进角质形成细胞增殖和抑制细胞凋亡，导致本病皮损的棘层肥厚和角化过度。

CLASPl蛋白属于着丝点外层成分，主要与胞质链接蛋白170（cytoplasmic linker protein-170，CLIP-170）相互作用，调节纺锤体微管动力学［12］。人CLASP1基因定位在2q14.2，编码蛋白分子量约150 kD［13］。我们发现SAK皮损中CLASP1表达明显高于皮损周围及正常皮肤。SAK皮损中CLASP1在棘层胞质呈强阳性染色，部分病例也有基底层和颗粒层着色；皮损周围及正常皮肤中，也可见棘层染色，但染色强度明显较弱。尽管人类皮肤中CLASP1免疫染色定位未见报道，但HeLa细胞中CLASPl蛋白常位于细胞边缘［13］与本文结果相似。微管是由α、β微管蛋白二聚体组成的高度动态化结构，主要调节细胞生长、运动、关键信号转导及应激反应［14］。因此，CLASP1表达上调可能促进角质形成细胞增殖和分化，导致SAK皮损的棘层肥厚和角化过度。另外，在正常乳腺皮肤中，激光共焦显微镜检查显示CLIP-170蛋白与1个效应器聚集于板层小体，并与板层小体中组织蛋白酶D（CTSD）有关联［15］。我们推测CLASP1蛋白可能也富集于板层小体，与CTSD有一定关联。CTSD在表皮分化阶段可激活转谷氨酰胺酶1，下调外皮蛋白和兜甲蛋白表达，降低角化细胞结合脂质能力和皮肤屏障功能，引起皮肤角化过度、脱屑［16］。CTSD也参与银屑病表皮过度增殖和异常分化过程［17］。我们同期的研究结果显示SAK皮损中CTSD表达增多，推测CLASP1可能与CTSD起协同作用，参与表皮过度增殖和异常分化。

综上所述，本研究首次发现SAK皮损中Prx I、CLASP1表达上调，可能参与角质形成细胞过度增殖和异常分化。

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（收稿:2015-08-22）

Expression of peroxiredoxin I and cytoplasmic linker associated protein 1 in lesions of symmetrical acrokeratoderma

YU Zuozhong，CHENG Yunlong，SHENG Ping，LI Shijie，FAN Yiming.
Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524001，China
Corresponding author:Fan Yiming，E-mail:ymfan1963@163.com

Objective:To detect the expression of peroxiredoxin I（Prx I）and cytoplasmic linker associated protein 1（CLASP1）in the lesions of symmetrical acrokeratoderma（SAK）.Methods:The level of Prx I and CLASP1 mRNA in lesions and perilesional skin from 9 patients and normal skin from 9 healthy controls was detected by RT-PCR and the level of protein was detected by immunohistochemistry.Results:The expression level of Prx I and CLASP1 mRNA in lesions was（0.94±0.66）and（0.95±0.76），which was higher than those in perilesional skin（0.51±0.20 and 0.56±0.31）and normal skin（0.45±0.26 and 0.47±0.33）. The positive cells of Prx I were predominantly located in the stratum spinosum and basal layers in the skin lesions，while the positive cells of CLASP1 were located in the stratum spinosum.The number of positive cells of Prx I and CLASP1 in lesions were more than those in the perilesional and normal skin.Conclusion:Over-expression of Prx I and CLASP1 may be involved in the hyperproliferation and abnormal differentiation of epidermal keratinocytes in the lesions of SAK.

symmetrical acrokeratoderma；peroxiredoxin I；cytoplasmic linker associated protein

广东医学院科技创新基金（编号:STIF201103）

广东医学院附属医院皮肤科，湛江，524001

樊翌明，E-mail:ymfan1963@163.com

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