内蒙古汉族寻常型银屑病REL基因多态位点检测

王　勇　韩建文　白云花　孙志强　阿拉腾楚鲁　刘　佳　李东霞　吕新翔　乌日娜

·短篇论著·

内蒙古汉族寻常型银屑病REL基因多态位点检测

王勇1韩建文2白云花3孙志强2阿拉腾楚鲁2刘佳2李东霞2吕新翔2乌日娜2

目的： 检测内蒙古汉族人寻常型银屑病（PsV）患者禽网状内皮组织增殖病毒癌基因V-Rel同源基因（REL）的多态性。方法： 提取301例PsV患者及292名正常对照外周血DNA，利用连接酶检测反应检测REL基因区域的4个单核苷酸多态性（SNP）（rs702873、rs 842636、rs13031237和rs13017599）。结果： PsV患者rs702873和rs842636的等位基因频率分别为0.126和0.128，对照组中分别为0.182和0.181，差异有统计学意义（P<0.05）且rs702873和rs 842636间存在强连锁不平衡（D'= 0.993，r2=0.980）。rs13031237和rs13017599等位基因频率在PsV患者和对照组中差异无统计学意义（P>0.05）。结论： REL基因位点（rs702873和rs 842636）多态性可能与内蒙古汉族人PsV的易感性相关。

寻常型银屑病? 单核苷酸多态性

银屑病是常见的红斑鳞屑性皮肤病。遗传、免疫在银屑病的发病机制中有着重要的作用。近年来的遗传学研究发现了一批银屑病易感基因，特别是核因子κB（NF-κB）病理通路中的禽网状内皮组织增殖病毒癌基因V-Rel同源基因（REL）与寻常型银屑病（PsV）、银屑病性关节炎的相关性在欧洲人群中已有报道［1-3］。并且REL基因与类风湿性关节炎也有相关性［3］。但目前尚无汉族人银屑病与REL基因多态性的相关研究。本研究选择则位于REL基因区域的4个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP），利用连接酶检测反应（ligase detection reaction，LDR）对其进行基因分型，探讨其与汉族人PsV的相关性。

1　资料和方法

1.1资料

1.1.1研究对象 从内蒙古医科大学附属医院收集汉族PsV患者301例，平均年龄（47.00±16.77）岁，平均发病年龄（33.48±15.48）岁?男女比例：1.76∶1，正常汉族对照292名，平均年龄（35.90±14.65）岁?男女比例：1.12∶1。经知情同意并签字后抽取外周静脉血5mL，EDTA抗凝，置于-80度冰箱保存备用。所有患者经临床及病理证实，符合PsV诊断标准。所有对照排除银屑病及其他自身免疫疾病，排除银屑病家族史。本研究经过内蒙古医科大学附属医院伦理委员会通过，并在实施过程中遵守赫尔辛基宣言。

1.1.2SNPs选择根据既往文献报道，在REL基因区域选择4个在欧洲人群中报道的银屑病相关的SNP（rs702873、rs842636、rs13031237和rs13017599）［1-3］。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取 利用基因组DNA提取试剂盒（康宁生命科学有限公司，中国苏州）提取患者及对照基因组DNA，利用分光光度仪检测260 nm和 280 nm吸光度，计算DNA浓度。并利用凝胶电泳检测DNA质量，所有DNA样本均合格。

1.2.2引物及探针的合成利用Primer 3 online（Version 0.4.0）软件（http：//frodo.wi.mit.edu/）和Oligo（Version 6.31）（Molecular Biology Insights Inc.，USA）软件设计特异性引物和LDR探针，针对每个SNP位点设计两条引物，要尽量保证所有SNP位点的引物的T值相同，PCR反应引物序列见表1。根据LDR探针设计原则设计LDR的上下游探针［4］，上游探针5'端用磷酸化修，LDR反应探针序列见表2。

表1　PCR反应引物序列

表2　LDR反应探针序列

1.2.3多重PCR反应 PCR反应体系为（20μL） 1 μL模板，2μL Buffer缓冲液，0.6μL Mg2+，2μL dNTP，0.2μL TaqDNA聚合酶，2μL引物混合液，加水补足。PCR反应条件：95℃预变性2 min?94℃30 s。56℃退火1.5 min。65℃30s，35个循环。最后65℃延伸10 min。

1.2.4多重LDR反应 LDR反应体系为（10μL） 1 μL Buffer缓冲液，1μL探针混合液，0.05μL Taq DNA连接酶，4μL PCR产物，加水补足10μL。探针混合液浓度为2 pmol/μL。LDR反应条件：95℃2 min预变性，94℃15 s，50℃25 s，进行40个循环。

1.2.5测序与基因分型反应产物 经过ABI3730测序仪测序分析，最后用Genemapper软件进行数据分析，判读各位点上各样本的基因分型。

1.2.6统计学方法 所有SNP分型数据质控、统计分析利用PLINK 1.07软件完成。（http：//pngu.mgh. harvard.edu/purcell/plink/）［5］。计算4个SNP的等位基因频率，病例组及对照中分别进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验。卡方检验（χ2）比较病例组及对照组等位基因频率及基因型频率，并计算等位基因的相对危险度估计值比值比OR及其95%可信区间（95%CI）。对4个SNP间进行连锁不平衡检验，计算两两间的r2和D'值。根据患者发病年龄（早发型：发病年龄<40岁?晚发型：发病年龄≥40岁）进行分层分析。所有统计检验均为双侧概率检验，根据Bonferroni多重检验校正原理，P<0.0125（0.05/4）为差异有显著性。

2　结果

2.1样本及SNP质控病例及对照样本在性别及年龄无显著性差异，具有可比性（P>0.05）。4个SNP在病例及对照中均符合Hardy-Weinberg遗传平衡（P> 0.05）。

2.2等位基因频率 比较2个SNP的等位基因频率与对照组差异具有显著性，达到Bonferroni校正水平（P<0.0125）（表3）。rs702873的等位基因A在PsV组的频率为12.6%，对照组中频率为18.2%（P= 0.0091，OR=0.65）。rs842636的等位基因A在PsV组的频率为12.8%，对照组中频率为18.1%（P= 0.0122，OR=0.66）。另外2个SNP（rs13031237和 rs13017599）的等位基因频率在病例组和对照组中无差异（P>0.6）。rs702873和rs842636间存在强连锁不平衡（D'=0.993，r2=0.980）。控制rs702873后，rs842636与PsV无相关性（Pconditional=0.72），同样控制rs842636后，rs702873也没有相关性（Pconditional=0.47）。

根据发病年龄分层分析结果显示，仅在晚发型PsV组中，rs702873和rs842636的等位基因频率与对照组的差异，但未能达到Bonferroni校正水平（P分别为0.0134和0.0207）。在早发型病例组无显著性（P> 0.05）。rs13031237和rs13017599的等位基因频率在分层分析中均无显著性差异（P>0.55）。

表3　四个SNP与PsV相关性及根据发病年龄分层分析

2.3基因型分析及根据发病年龄分层结果 在不同遗传模式下比较病例组和对照组间基因型频率，发现rs702873在显性遗传模式下，基因型AA+AG在PsV组中频率为0.239，对照组中频率为0.336（P= 0.0099，OR=0.62，95%CI：0.43～0.89），隐形遗传模式下无显著性。在分层分析后，早发型和晚发型的基因型频率差异无显著性差异（P>0.0125）。在显性模式下，PsV组和对照组间（P=0.0143）、晚发型与对照组间（P=0.0347）的差异显著，但未能达到Bonferroni校正水平。rs842636、rs13031237和rs13017599的基因型分析及根据发病年龄分层分析中均无显著性差异（P>0.0125）。

3　讨论

REL基因位于2p16.1，编码c-Rel蛋白是NF-κB通路中的一种泛素蛋白。参与调节多种免疫反应、自身免疫相关基因的表达［6］。

既往在欧洲人群中的多项研究报道了REL与银屑病及银屑病性关节炎的相关性［1-3］。本研究基于既往欧洲人群的研究对位于REL基因区域的4个SNP与PsV的相关性进行研究，证实了REL基因多态性与汉族人具有相关性。2个相关的SNP（rs702873和rs842636）间存在强连锁不平衡，提示2个SNP可能代表同一个关联信号。既往研究发现NF -κB病理通路中的一些相关基因均与银屑病具有相关性，例如核因子kB抑制蛋白α亚基（NFKB1A）［7］、人肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（TNFAIP3）［8］以及TNFAIP3相互作用蛋白1（TNIP1）［8-10］。这些研究提示NF-κB病理通路在银屑病的发病机制中具有重要的作用。

但是本研究没有发现rs13031237和rs13017599两个SNP与银屑病的相关性。查询既往研究文献，比较这两个SNP在欧洲人群和汉族人群的等位基因频率，发现存在明显差异。rs13031237的等位基因T和rs13017599的等位基因A在本研究中频率很低（小于0.03），但是在欧洲人群中的等位基因常见变异（频率大于0.29）［2，3］。这一发现提示可能存在遗传异质性。可能是由于汉族人和欧洲人群中这一区域遗传变异的连锁不平衡关系不同导致的。rs702873在显性模式下与PsV的相关性最为显著，提示这一遗传变异呈显性遗传模式。在根据发病年龄分层分析结果显示rs702873和rs842636与晚发型PsV具有相关性。这一结果提示这2个SNP可能与晚发型PsV的易感性相关，但是由于样本量不够大，未能达到Bonferroni校正水平，还需要更大样本量的验证实验来证实这一假设。

本研究通过对REL基因区域4个SNP进行分型研究（rs702873、rs842636、rs13031237和rs13017599），证实了其与汉族人PsV的相关性，REL基因可能是多个种族中银屑病的共同易感基因，但不同种族间存在有遗传异质性。更进一步提示REL基因在银屑病发病机制中发挥着重要的作用。本研究仍存在一些不足之处：第一，由于样本量有限，我们不能排除rs13031237和rs13017599与汉族人银屑病的相关性，也不能除外rs702873和rs842636与早发型PsV的相关性?第二，本研究所分析的4个SNP均不是功能变异，仍需要进一步的精细定位研究寻找导致影响银屑病易感性的原因变异?第三，REL基因多态性如何影响其基因功能以及如何影响免疫系统功能，仍需要进一步功能学研究。

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（收稿：2015-09-14）

Detection of the polym orphism s of REL gene in the patients w ith psoriasis vulgaris in Han nationality of Inner Mongolia

WANG Yong1，HAN Jianwen2，BAIYunhua3，SUN Zhiqiang2，ALATENGChulu2，LIU Jia2，LIDongxia2，LV Xinxiang2，WU Rina2.
1.Department ofRheumatology，the Affiliated Hospital of InnerMongolia Medical University，Hohhot010050，China?2.Department of Dermatology，the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010050，China?3.Department of Dermatology，Hulunbeier People's Hospital，Hulunbeier021000，China

HAN Jianwen，E-mail：hanjianwen1981@hotmail.com

Objective：To detect the polymorphisms of REL（v-rel avian reticuloendotheliosis viral oncogene homolog）in Han nationality of Inner Mongolia.M ethods：DNA was extracted from the peripheral blood of 301 patients and 292 healthy controls.The polymorphisms of REL gene（rs702873，rs 842636，rs13031237 and rs13017599）were genotyped by PCR-based ligase detection reaction（PCR-LDR）.Results：The genotype frequencies of rs702873 and rs 842636 in the patientswere 0.126 and 0.128 and those in controlswere 0.182 and 0.181，with significantdifference（P<0.05）.Therewas a linkage disequilibrium of rs702873 and rs 842636.There was no significant difference in rs13031237 and rs13017599 between the patients and controls（P>0.05）.Conclusion：The polymorphisms of REL gene（rs702873 and rs842636）are associated with psoriasis vulgaris in Han nationality of Inner Mongolia.

psoriasis vulgaris?single nucleotide polymorphisms

国家自然科学基金（编号：31160192）?内蒙古医科大学青年创新基金项目（编号：NY2011QN005）?内蒙古自治区卫生和计划生育委员会医疗卫生科研计划项目（编号：201303057）?

内蒙古自治区高等学校青年科技英才支持计划（编号：NJYT -14-B17）

1内蒙古医科大学附属医院风湿科，呼和浩特，010050

2内蒙古医科大学附属医院皮肤科，呼和浩特，010050

3呼伦贝尔市人民医院皮肤科，呼伦贝尔市，021000

韩建文，E-mail：hanjianwen1981@hotmail.com