满山红中黄酮类成分液相色谱指纹图谱研究

李红梅，佟志军，孙　丽，王安波，张　雷

(1.通化东宝药业股份有限公司,吉林 通化 134123;2.吉林天力泰药业有限公司，吉林 长白 134400;3.长春中医药大学 长春130117)



满山红中黄酮类成分液相色谱指纹图谱研究

李红梅1，佟志军2*，孙丽2，王安波2，张雷3

(1.通化东宝药业股份有限公司,吉林 通化 134123;2.吉林天力泰药业有限公司，吉林 长白 134400;3.长春中医药大学 长春130117)

目的利用反相高效液相色谱法建立满山红中黄酮类成分的指纹图谱，为科学评价及有效控制满山红药材质量提供新的方法。方法分析10个不同产地满山红样品的色谱图，采用国家食品药品监督管理局推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”计算处理，建立由18个共有峰及其他指纹峰组成对照指纹图谱，确定2个主要指纹峰。结果通过夹角余弦法和相关系数法计算满山红10个样品与对照指纹图谱的相似度，得到满意结果。结论所建立的对照指纹图谱可以用来区别不同产地满山红药材的优劣，为进一步控制满山红质量提供依据。

高效液相色谱；满山红；指纹图谱；质量控制

满山红为杜鹃花科植物兴安杜鹃RhododendrondamricumL.的干燥叶。主要分布于黑龙江、吉林、内蒙古。满山红主要有效成分为挥发油和黄酮类成分，后者主要有金丝桃苷、杜鹃素、山奈酚、槲皮素杨梅酮、黄梅素等。具有止咳、祛痰作用[1]。目前《中国药典·1部》满山红项下只有鉴别和测定杜鹃素含量(大于0.08%)[2]，这种单一成分的检测并不足以表明药材质量。中药指纹图谱是控制中药材质量的有效方式之一，已日益成为国内外广泛接受的中药质量评价模式[3]。

1　仪器与试药

1．1仪器高效液相色谱仪A111iane2695(Waters公司)；AG245型电子天平(瑞士梅特勒公司)；SK3200型超声波清洗仪(上海科导超声有限公司)。

1．2药品与试剂金丝桃苷，批号:141211，供含量测定用，购于上海融禾医药科技有限公司；杜鹃素，批号:1108-2006041，供含量测定用，购于中国食品药品检定研究院。满山红叶于2014年9月末—10月初采于黑龙江省和吉林省不同10个地区。经长春中医药大学鉴定教研室鉴定为兴安杜鹃叶。甲醇、石油醚(30～60 ℃)、乙酸乙酯、乙醇均为分析纯。甲醇、乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)；乙酸为色谱纯(美国Fedia公司)；水为哇哈哈纯净水。

2　方法与结果

2．1色谱分析Weters Cortees C18柱(100 mm×4．6 mm，2．7 μm)，以甲醇为流动相A，以0．3%醋酸溶液为流动相B，梯度洗脱:0～15 min，15%A～25%A，30～50 min，25%A～45%A,60～70 min，45%A～85%A,85～90 min，85%A～100%A，流速:0．6 mL/min；柱温:30 ℃；检测波长:300 nm。理论板数按杜鹃素峰计应不低于5 000。

2．2参照物溶液的制备取杜鹃素对照品和金丝桃苷对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1 mL含杜鹃素0．52 mg、金丝桃苷0．59 mg的溶液，即得。

2．3供试品溶液的制备取满山红细粉约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加60%甲醇70 mL，超声处理(功率250 W，频率33 kHz)40 min，滤过，用60%甲醇洗涤滤渣，洗液并入滤液中，滤液蒸干，残渣加水30 mL，转移置分液漏斗中，用石油醚(30～60 ℃)30 mL提取，弃去石油醚，用乙酸乙酯提取3次(30、25、25 mL)，合并提取液，残渣用甲醇溶解转移至25 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。2．4测定精密吸取对照溶液及供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录90 min色谱图，即得。

2．5方法学考察2．5．1精密度试验取同一批样品，按供试品溶液制备方法制成供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图。结果表明各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在1%和5%以内，说明精密度良好。

2．5．2重复性试验取同一批样品，平行制备6份供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图，结果表明各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在2%和5%以内，说明重复性很好。

2．5．3稳定性试验取供试品溶液，分别在0、2、8、16、24 h进样，记录色谱图，结果表明各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在1%和5%以内，说明供试品溶液中成分在24 h内是稳定的。

2．6满山红中黄酮类成分指纹图谱的建立在优化的色谱条件，对10个不同产地满山红药材供试品溶液进行HPLC测定，记录HPLC色谱图。将10批样品的指纹图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”(2004A版),生成指纹图谱共有模式。在90 min内出现18个共有峰，通过与对照品的HPLC色谱比较，确定8号峰为金丝桃苷、16号峰为杜娟素峰，以杜娟素峰为参照峰，即S峰，依次标记为1～18。

满山红中黄酮类成分共有模式指纹图谱，见图1。

图1　满山红黄酮类成分共有模式指纹图谱

对照品的HPLC色谱图，见图2。

图2　前峰为“金丝桃苷”，后峰为“杜鹃素”

特征指纹峰的共有模式的10批供试品的叠加图，见图3。

图3　10批供试品的叠加图

2．7不同产地的满山红药材中黄酮类成分相似度比较以共有模式作为对照指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”(2004A版)对10批不同产地样品指纹图谱进行相似度评价，利用夹角余弦法和相关系数法计算每个样品与基本样本,得到每个样品的色谱与对照指纹图谱的相似度，结果10批满山红药材大部分指纹图谱的相似度良好，均在0．90以上，符合要求。这表明存在这种共有模式基础上的个体差异是常见现象，因为药材生长过程中受多因素影响，因此需要对药材进行规范化种植，保证药材质量的稳定性。

3　小结

首先考察回流法和超声法，结果二者指纹图谱相似，但回流法供试品中叶绿素多，故采用超声法。其次考察提取溶剂:甲醇和乙醇，结果甲醇提取供试品溶液色谱峰多，叶绿素少，又进一步考察甲醇浓度及甲醇用量，最终确定60%甲醇，超声处理40 min，用量为70 mL为宜。本试验选用3个公司反相C18柱，最终选择Weters Cortees C18柱(100 mm×4．6 mm，2．7 μm)色谱柱分离度较好，峰谱信息丰富，保留时间适中。实验中分别对乙腈-0．3%醋酸水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-0．3%醋酸水溶液等流动相系统进行梯度洗脱，结果表明，后者分离效果好。实验中对20、30、35 ℃ 3种柱温进行选择，结果选择柱温30 ℃为宜。流速考察了0．5、0．6、0．8 mL/min 3种流速，结果显示流速为0．6 mL/min时，各色谱峰分离度较好。

对不同产地满山红药材中黄酮类成分的指纹图谱分析可以看出:共有峰的相对保留时间非常接近，RSD很小(1%)，但相对峰面积相差较大，RSD为5%，即不同产地满山红药材中总黄酮的含量差异较大，为保证药材质量，应建立药材栽培基地。

[1]吉林省中医中药研究所.长白山植物药志[M].长春:吉林人民出版社,1985:870.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典:1部[M].北京:中国医药科技出版社,2010:339.

[3]谢培山.中药色谱指纹图谱[M].北京:人民卫生出版社,2005:124.

Rhododendron dauricum L.flavonoids ingredients in HPLC fingerprint

LI Hongmei1，TONG Zhijun2*，SUN li2，WANG Anbo2，ZHANG Lei3

(1.The Tonghua Dongbao Pharmaceutical co.,LTD.,Tonghua 134123,Jilin Province,China;2.Tianlitai Pharmaceutical co.,LTD.,Changbai 134400,Jilin Province,China;3.Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

ObjectiveThe chromatographic fingerprint was established for evaluating and controlling the quality of Rhododendron dauricum L.by reversed-phase high performance liquid chromatog-raphy (RP-HPLC).MethodsTen different original samples were analyzed,and the chromatographic fingerprint of Rhododendron dauricum L.was constructed with 18 fingerprint peaks,among which peaks were common fingerprint peaks and 2 main compounds were identified using the Similarity Evaluation System of Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine (Version 2004A) recommended by State Food & Drug Administration.ResultsMethods of vectorcosine and correlation coefficient were used to calculate the similarity of ten samples,and sat-is factory results were obtained.ConclusionThe chromatographic fingerprint can be used to differentiate the raw materials from different sources and be served as a powerful tool for the further quality control of Rhododendron dauricum L.

Liquid chromatography (LC);Rhododendron dauricum L;fingerprint;quality control

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.04.017

吉林省科学技术厅项目(20130727101YY)。

李红梅(1970-)，女，大学本科，副高级检验师，主要从事中药化学成分及质量标准研究。

佟志军，电话-15844955777，电子信箱-jlcbsyy@126.com

R284.3

A

2095-6258(2016)04-0708-03

2015-12-28)