二至丸对D-半乳糖诱导衰老模型大鼠脑组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅳ含量的影响

赵雪莹，韩伟丽，徐　丹，高长玉

(黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)



·实验研究·

二至丸对D-半乳糖诱导衰老模型大鼠脑组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅳ含量的影响

赵雪莹，韩伟丽，徐丹，高长玉*

(黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)

目的观察二至丸对D-半乳糖致衰老模型大鼠脑组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅳ含量的影响，探讨二至丸抗氧化的作用机制。方法采用D-半乳糖诱导衰老模型大鼠，测定大鼠脑组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅳ含量。结果二至丸各治疗组较模型对照组大鼠脑组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅳ含量显著降低。结论二至丸能够提高机体的抗氧化能力，可能与其能够降低体内活性氧含量有关，从而延缓机体的衰老进程。

二至丸；D-半乳糖；线粒体呼吸链复合物；Ⅰ、Ⅳ;衰老

二至丸出自明·王三才《医便》，该方仅由女贞子、旱莲草2味草药组成，可滋补肝肾，临床上有治疗头目眩晕、视物昏花、腰酸背痛、须发早白等功效[1]。本实验采用D-半乳糖腹腔注射法复制衰老大鼠模型，在前期研究的基础上，观察二至丸对衰老大鼠脑组织线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ含量的影响，探讨二至丸对抗氧化系统的影响及其延缓衰老的作用。

1　材料与方法

1．1材料

1．1．1实验动物清洁级Wistar大鼠60只(雌雄各半)，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供[SCXK(吉)-2011-0004]，体质量(200±20)g，饲养在黑龙江省中医药基础重点实验室，温度(22±2)℃、湿度40%～70%、光照周期12 h、自由进食进水。

1．1．2实验药物与制备D-半乳糖:美国Sigma药品公司，批号:0637。二至丸:女贞子1 000 g，旱莲草1 000 g，蜂蜜120 g，购自黑龙江中医药大学门诊部；女贞子、旱莲草研磨粉碎，过100目筛备用[2]。两生药混合根据实验需要分别配置成高、中、低浓度的药液(0．324、0．162、0．081 g/mL)，4 ℃保存。维生素E:青岛双鲸药业有限公司，国药准字:H37023084，批号:130102，购自哈尔滨恒瑞新药特药店。金龙鱼大豆油(特炼一级)，哈尔滨益海嘉里粮油食品工业有限公司。将维生素E溶于大豆油中，浓度0．013 5 g/mL，常温保存。线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅳ测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，生产批号:201403)。

1．1．3实验仪器酶标仪，郑州博赛生物工程有限责任公司；KDC-40低速离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器厂；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司。

1．2实验方法

1．2．1实验分组将60只Wistar大鼠(雌雄各半)随机分成6组:空白组、模型组、维生素E组、二至丸高、中、低剂量组，每组10只(雌雄各半)，适应性饲养1周，自由进食进水。

1．2．2造模方法采用D-半乳糖复制大鼠亚急性衰老模型[3]。将5 000 mg D-半乳糖溶于500 mL生理盐水中，按照100 mg/(kg·d)的剂量给大鼠(空白组除外)腹腔注射给药[4]，空白组则给等量的生理盐水，1次/d。每周称重1次，根据体质量调节给药剂量，连续给药8周，实验过程中大鼠自由进食进水。

1．2．3给药方法造模成功后，各给药组从第9周开始每日分别灌胃给药，空白组和模型组分别灌胃等体积的生理盐水。二至丸各剂量组给药浓度分别为:低剂量组0．81 g/kg，中剂量组1．62 g/kg，高剂量组3．24 g/kg；维生素E组0．027 g/kg。每周给大鼠称重1次，根据体质量调整给药剂量。连续给药10周。

1．3指标测定末次给药后，将大鼠禁食不禁水24 h后断头取材。取大鼠脑组织适量(剩余脑组织保存于-80 ℃待用)，加生理盐水以1∶9比例于冰上匀浆，应用KDC-40低速离心机离心3 000 r/min，离心20 min，取组织匀浆上清用于指标测定。线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅳ含量测定方法参照试剂盒说明书。

2　结果

2．1二至丸对D-半乳糖诱导衰老模型大鼠脑组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ含量的影响见表1。

组 别剂量/(g/kg)线粒体呼吸链复合物Ⅰ空白组 —1.93±0.57 模型组 —4.36±1.06△△维生素E组 0.0272.25±0.52##二至丸低剂量组0.8103.06±0.78#△二至丸中剂量组1.6202.26±0.59##二至丸高剂量组3.8402.07±0.55##

注:与模型组比较，#P﹤0．05，##P﹤0．01；与高剂量组比较，△P﹤0．05，△△P﹤0．01

2．2二至丸对D-半乳糖诱导衰老模型大鼠脑组织线粒体呼吸链复合物Ⅳ含量的影响见表2。

组 别剂量/(g/kg)线粒体呼吸链复合物Ⅳ空白组 —1.40±0.76 模型组 —4.93±1.28△△ 维生素E组 0.0271.81±0.88## 二至丸低剂量组0.8103.47±1.58##△二至丸中剂量组1.6202.79±1.19## 二至丸高剂量组3.8402.05±1.05##

注:与模型组比较，#P﹤0．05，##P﹤0．01；与高剂量组比较，△P﹤0．05，△△P﹤0．01

3　讨论

研究表明，90%以上的氧气在线粒体中经呼吸链被还原。线粒体消耗的氧约有2%～5%用于生成H2O2及O2-，二者均为活性氧，如果不能被及时清除，则很快经Fenten反应生成活性氧自由基，对机体有害。氧自由基一旦聚集积聚，则造成与ATP酶相偶联的共同完成线粒体合成ATP的能量系统代谢异常，线粒体产能不足，不能满足其呼吸链的正常功能，致使线粒体呼吸链复合物无法正常代谢进而产生堆积[5]。在线粒体呼吸链复合物中,复合物Ⅰ是体内能量物质转化合成ATP的桥梁,而复合物IV极脆弱且不稳定，易受到活性氧自由基的攻击，细胞色素氧化酶结合电子的能力在复合物IV受到破坏的情况下就会减弱，导致ATP合成减少，呼吸产能过程出现不可逆的损伤[6]。

线粒体呼吸链不仅受到活性氧自由基的影响，还与线粒体DNA氧化损伤有关。当机体出现衰老时，线粒体功能逐渐减退，呼吸链复合物的含量在各组织中均有不同程度的升高(尤其是脑组织)。当呼吸链功能逐渐下降不能满足氧化磷酸化的需求时，就会产生过多的活性氧自由基，造成线粒体DNA氧化损伤；线粒体DNA氧化损伤后，又可引起呼吸链相关蛋白酶亚单位合成异常,线粒体氧化磷酸化功能出现障碍，更加促进活性氧自由基的产生，线粒体DNA的损伤进一步加重，最终机体组织呼吸频率下降，氧化磷酸化反应进行性减退。当经线粒体产生的能量不足，不能维持细胞正常的功能时，细胞、组织开始退化，从而引发衰老[6]。

研究[1，7-9]表明，二至丸可以明显提高衰老大鼠SOD、GSH-PX、CAT、POD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，降低MDA、LPO含量。本研究发现二至丸能在一定程度上降低衰老大鼠脑组织中线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅳ的含量；在二至丸各剂量组中，高剂量组疗效最佳。说明二至丸能够一定程度上改善线粒体呼吸链的生理机能，增强机体清除活性氧自由基能力，通过间接降低线粒体DNA的氧化损伤，起到抗氧化防止衰老的作用。

[1]赵雪莹,王浩然,旺建伟,等.二至丸对衰老模型大鼠Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶影响的研究[J].中医药信息,2012,29(6):31-32.

[2]罗玲英,熊艺芬,吴铁荣.二至丸的制备工艺研究[J].亚太传统医药,2011,7(3):41-42.

[3]王少康,孙桂菊,张建新,等.亚急性衰老动物模型的建立及评价[J].东南大学学报,2002,21(3):217-219.

[4]李仪奎,金若敏,王钦茂.中药药理实验方法学[M].2版.上海:上海科学技术出版社,2006:992-994.

[5]徐建兴.呼吸链的电子漏路径和线粒体的超氧自由基代谢及其生物学意义[J].基础医学与临床,2001,21(5):389-393.

[6]孙巍.脾阳虚证衰老大鼠心肌线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅳ活性和线粒体DNA缺失的实验研究[D]沈阳：.辽宁中医药大学,2006.

[7]赵雪莹,闫忠红,李冀.二至丸对D-半乳糖致衰老模型大鼠CAT、GSH-PX影响的实验研究[J].中医药信息,2010,27(2):34-36.

[8]李胜志,赵雪莹,李冀.二至丸对D-半乳糖致衰老模型大鼠SOD、MDA影响的实验研究[J].中医药信息,2008,25(3):37-38.

[9]张喆,高长玉,韩伟丽,等.二至丸对D-半乳糖致衰老模型大鼠血清POD活性、LPO含量影响的实验研究[J].中医药学报,2013,41(6):79-81.

Erzhi pill on mice' mitochondrial respiratory chain complexes Ⅰ,Ⅳ content induced by D-galactose

ZHAO Xueying,HAN Weili,XU Dan,GAO Changyu*

(Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

ObjectiveTo study the effect of Erzhi pill on mice' mitochondrial respiratory chain complexes Ⅰ,Ⅳ content induced by D-galactose,and discuss the mechanism of antioxidant effect of Erzhi pill.MethodsDeterminate mitochondrial respiratory chain complexes Ⅰ,Ⅳ content with aging mice models induced by D-galactose.ResultsAll doses of Erzhi pill groups could significantly reduce the mitochondrial respiratory chain complexes Ⅰ,Ⅳ content which compared with model group.ConclusionErzhi pill could improve the body's antioxidant capacity,and delay body's aging process.

Erzhi pill;mitochondrial respiratory chain complexes Ⅰ,Ⅳ;aging

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.04.006

黑龙江中医药大学博士创新基金(B201102)；黑龙江省博士后科研启动金资助项目(LBH-Q12009)；黑龙江省教育厅青年学术骨干项目(1253G053)；黑龙江中医药大学优秀青年教师支持计划项目。

赵雪莹(1978-)，女，副教授，硕士研究生导师，主要从事方剂配伍及疗效客观化研究。

高长玉，男，教授，硕士研究生导师，电子信箱-zhaoxueying78@sina.com

R285.5

A

2095-6258(2016)04-0676-03

2015-06-13)