杜洛克猪与梅山猪副性腺组织学比较及精浆蛋白mRNA表达分析

丁海生，徐德全，2，3，罗　琰，刘　敏，2*

(1.华中农业大学动物科技学院 动物医学院，武汉 430070；2.农业部猪遗传育种重点实验室，武汉 430070；3.生猪健康养殖协同创新中心，武汉 430070)



杜洛克猪与梅山猪副性腺组织学比较及精浆蛋白mRNA表达分析

丁海生1，徐德全1，2，3，罗琰1，刘敏1，2*

(1.华中农业大学动物科技学院 动物医学院，武汉 430070；2.农业部猪遗传育种重点实验室，武汉 430070；3.生猪健康养殖协同创新中心，武汉 430070)

旨在探讨杜洛克公猪和梅山公猪精囊腺和尿道球腺的组织学特征及精浆蛋白mRNA的表达，运用石蜡切片并通过HE染色，分别在光学显微镜下对75日龄、270日龄梅山公猪与270日龄杜洛克公猪的精囊腺和尿道球腺进行组织学观察；并用实时荧光定量PCR对精浆蛋白mRNA的表达进行分析。270日龄梅山公猪与75日龄梅山公猪相比，精囊腺的腺小叶增多，小叶间结缔组织减少；270日龄杜洛克公猪精囊腺较270日龄梅山公猪有更多的腺泡黏膜褶皱和小叶间结缔组织。梅山公猪和杜洛克公猪尿道球腺被结缔组织分隔成小叶，腺泡密集且腺腔小；梅山猪在成年时尿道球腺腺小叶增大，小叶间结缔组织变少；270日龄杜洛克公猪尿道球腺腺小叶比270日龄梅山公猪小，而腺泡较大，且结缔组织更多。精浆蛋白PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ在精囊腺中高表达，在成熟的杜洛克和梅山公猪精囊腺中其mRNA表达水平相近(P>0.05)。但随着日龄的增长，梅山公猪PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。杜洛克公猪更多的精囊腺黏膜褶皱和更大的尿道球腺腺泡，增加了上皮分泌面积，有助于增加精浆体积，提高精子代谢率和存活率。另外，性成熟公猪中精浆蛋白PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ的高表达可能参与维持精子的代谢和活力等生理过程。

猪；副性腺；组织学；PSP-Ⅰ；PSP-Ⅱ

副性腺是雄性生殖系统的重要组成部分，主要包括精囊腺、前列腺和尿道球腺等，其各自分泌的特异性液体是精液的组成部分，对于精子的运送、保护及存活都有一定意义[1]。精囊腺为一对蟠曲的囊状结构，与性功能的调控有关[2]。精囊腺分泌物构成精浆的大部分，为精子提供营养物质和能量，有助于提高精子活力、刺激子宫蠕动、促进精子在雌性生殖道内运动[3-5]。如精囊腺上皮细胞分泌的PSP-Ⅰ(Porcine seminal protein-Ⅰ)和PSP-Ⅱ(Porcine seminal protein-Ⅱ) 的含量约占精浆总蛋白的50%，在精液中主要以非共价异源二聚体形式存在，是精子粘附家族的重要成员，参与体内多种生物学功能，能够维持精子膜的完整性、精子能动性和精子线粒体的活性等[6-8]。尿道球腺是由具有分泌功能的腺泡构成的，其主要功能是分泌尿道球腺液，而尿道球腺液也是精液的组成成分之一，可保护精子免受阴道不利环境的影响及防止精液倒流，公猪尿道球腺液中的糖复合物可能参与精子代谢过程[9-10]。

梅山猪以性成熟早、繁殖性能高闻名于世，而杜洛克猪在杂交育种中常作为终端父本。梅山公猪初情期为56～84日龄，而杜洛克、大白公猪等外来猪种的初情期一般为120～180 日龄，且梅山公猪精子发生时间较早，但每次射精量、睾丸日产精量等一般低于杜洛克公猪[11-14]，这可能也与副性腺液的产量和组成相关。因此，本研究对杜洛克和梅山公猪精囊腺和尿道球腺进行石蜡切片制作及苏木精-伊红染色法(Haematoxylin-eosin，HE)染色观察，阐述其结构特征和差异性，并对精囊腺中高表达的精浆蛋白PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ进行实时荧光定量PCR分析，研究杜洛克和梅山公猪精囊腺和尿道球腺的组织结构特征及精浆蛋白mRNA的表达，探索杜洛克公猪和梅山公猪精子产量、精子活力等性状差异的基础，为公猪繁殖性状的评价与改良奠定基础，为中国地方猪种优异种质资源的进一步开发与利用提供新思路。

1　材料与方法

1.1试验动物

由于梅山公猪初情期仅为56～84日龄，早于杜洛克公猪(初情期为120～180日龄)，因此在华中农业大学精品猪场分别选用健康的已达初情期的75日龄梅山公猪(体重分别为18、21、和23 kg)、已性成熟的270日龄的梅山公猪(115、119和125 kg)和杜洛克公猪(体重分别为184、192和196 kg)各3头实施手术，采集精囊腺和尿道球腺组织后，生理盐水漂洗、剔除结缔和脂肪组织，切成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm小块，一部分用于组织切片制作和HE染色观察，另一部分经液氮速冻置-80 ℃保存，用于RNA提取。

1.2石蜡切片制作及HE染色观察

用0.01 mol·L-1PBS (pH7.4) 洗涤多聚甲醛缓冲液(4.0%)固定的组织块3次，然后用梯度酒精脱水、二甲苯或水杨酸甲酯透明处理及60 ℃浸蜡后进行包埋，采用莱卡切片机(RM2235，Leica)切片，制作5 μm厚的石蜡切片。将已经切好的组织放入40 ℃温水中展开，选择完整、无皱褶的组织黏贴于干净的载玻片上，作好标记，然后置于漂烘仪(TEC-2500，常州)上40 ℃烘片1 h左右，待水分烘干后置于60 ℃烘箱过夜，次日用二甲苯脱蜡；再用梯度酒精置换二甲苯；蒸馏水洗去酒精后用苏木素染液染色8 min；1.0%盐酸酒精分化1 min，然后蒸馏水洗2 s；梯度酒精脱水各2 min；伊红染液染色2 min；再用梯度酒精脱水各2 min；二甲苯透明后滴加适量中性树胶封片，用Olympus-BX51显微镜观察拍照[15-16]。

1.3实时荧光定量PCR

采用SYBR Green I染料法，反应在Bio-Bio Rad CFX384TMReal-Time PCR Systems上进行。PCR反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,40个循环；4 ℃保存。qRT-PCR的反应体系为10 μL：CWBIO 2×Es Taq Master Mix 5 μL，上下游引物(72.5 μmol·L-1)各0.15 μL，cDNA模板为0.5 μL，加灭菌去离子水至10 μL。基因引物设计采用Primer premier 5.0，各引物序列见表1，退火温度为60 ℃。

表1实时荧光定量PCR引物

Table 1Primers for real-time PCR

目的基因Targetgenes引物序列(5'-3')Primersequence产物大小/bpProductslengthPSP-ⅠF:GGAGCCCCAGGATCTAAGAG,R:GTGGAAGATCACGCTCATCA211PSP-ⅡF:AATCTGTGCACCTGGACCAT,R:AAAAGACAATCGCTGCACCT163β-actinF:CCAGGTCATCACCATCGG,R:CCGTGTTGGCGTAGAGGT158

1.4数据处理与分析

所有数据采用Excel进行整理，利用t检验进行统计处理，P>0.05表示差异不显著；P<0.05表示差异显著；P<0.01表示差异极显著。n=3。结果用“平均数±标准差”表示。运用作图软件GraphPad Prism进行图的绘制。所有组织的PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ mRNA表达量均是以β-actin为内参基因。

2　结　果

2.1杜洛克与梅山公猪精囊腺组织学形态观察

75日龄、270日龄梅山公猪以及270日龄杜洛克公猪的精囊腺组织结构结果见图1。结果显示杜洛克和梅山公猪精囊腺为分叶腺，包含有多个大的腺小叶，小叶间以疏松的结缔组织相连接，腺黏膜伸出一系列皱褶，黏膜皱褶突入腔内，使黏膜呈蜂窝状，黏膜泡内可见大量的精囊腺分泌物。品种内相比，梅山公猪从75～270日龄腺小叶增多，且更加密集紧致，小叶间结缔组织减少。品种间相比，270日龄梅山公猪与杜洛克公猪腺小叶数目类似，但其腺泡黏膜褶皱少于270日龄杜洛克公猪，且其小叶间结缔组织隔膜比270日龄杜洛克公猪稀疏。

2.2杜洛克与梅山公猪尿道球腺组织学形态观察

75日龄、270日龄梅山公猪以及270日龄杜洛克公猪的尿道球腺组织结构结果见图2，结果显示梅山公猪和杜洛克公猪尿道球腺被纤维结缔组织分隔成小叶。尿道球腺腺泡密集成小圆形，且腺腔小。品种内相比，270日龄梅山公猪比75日龄的腺泡更加密集紧实，腺小叶更大，小叶间结缔组织稀少。而品种间相比，270日龄杜洛克公猪有更大的腺泡，且小叶间结缔组织更多，但其腺小叶却小于270日龄梅山公猪。

2.3猪PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ mRNA表达量的检测

由图3可以看出，PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ在75日龄梅山公猪、270日龄的杜洛克和270日龄梅山公猪精囊腺中表达量均极显著高于尿道球腺(P<0.01)。品种内，270日龄的梅山公猪精囊腺和尿道球腺中PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ mRNA表达量均显著高于75日龄梅山公猪(P<0.05)；品种间，270日龄梅山公猪和杜洛克公猪精囊腺和尿道球腺PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ mRNA表达量均相近(P>0.5),但其蛋白水平是否存在差异需要进一步验证。

3　讨　论

副性腺分泌物是精浆的重要组成成分，其主要功能是作为精子的运载介质，帮助精子运动，防止自然交配时，精液倒流。猪精囊腺和尿道球腺都特别发达，且精浆大部分成分来自精囊腺和尿道球腺，这可能是公猪射精量远高于其他家畜的原因之一[17-18]。研究75、270日龄梅山公猪和270日龄杜洛克公猪的精囊腺和尿道球腺为公猪生精能力的差异奠定基础。公猪精囊腺是呈分叶状的腺体，位于输精管壶腹外侧。图1显示270日龄的梅山公猪精囊腺比75日龄的梅山公猪有更加密集的腺小叶和更深更多的黏膜褶皱。由于精囊腺分泌物中碳酸氢盐能够增强精子活力[19]，性成熟梅山公猪较多的黏膜褶皱能够分泌较多的精囊腺分泌物，因此这可能也是性成熟的梅山公猪精子活力高于初情期的梅山公猪的原因之一[11]。另外，270日龄杜洛克公猪与270日龄的梅山公猪相比，其精囊腺腺泡上皮的黏膜褶皱更多，黏膜褶皱扩大了分泌面积并有利于分泌物的贮存和腺体的扩张。因此性成熟的杜洛克公猪可比梅山公猪分泌更多的精囊腺分泌物以及具有更强的排出分泌物的能力。更多的精囊腺分泌物增加精液中精浆的量以及对精子的营养和能源供给，且精囊腺分泌物能够提高精子核染色质的稳定性和抑制雌性生殖道对精子的免疫反应[19-21]，这也可能是两品种在日产精量、精子活力等繁殖性状方面存在差异的原因之一。

A.75日龄梅山公猪精囊腺；B.270日龄梅山公猪精囊腺；C.270日龄杜洛克公猪精囊腺。GL.腺小叶；Ac.腺泡；S.分泌物；ICT.小叶间结缔组织A.Vesicular gland of 75-day-old Meishan boar；B.Vesicular gland of 270-day-old Meishan boar；C.Vesicular gland of 270-day-old Duroc boar.GL.Glandular lobule；Ac.Acinus；S.Secreta；ICT.Interlobular connective tissue图1　不同日龄杜洛克与梅山公猪精囊腺组织学观察(苏木精-伊红染色，100×)Fig.1　The histological observation of vesicular gland from Duroc and Meishan boars at different age(Haematoxylin-eosin staining，100×)

A.75日龄梅山猪尿道球腺；B.270日龄梅山猪尿道球腺；C.270日龄杜洛克猪尿道球腺。Ac.腺泡；ICT.小叶间结缔组织；GL.腺小叶A.Bulbourethral gland of 75-day-old Meishan boar；B.Bulbourethral gland of 270-day-old Meishan boar；C.Bulbourethral gland of 270-day-old Duroc boar.Ac.Acinus；ICT.Interlobular connective tissue；GL.Glandular lobule图2　不同日龄杜洛克与梅山公猪尿道球腺组织学观察(苏木精-伊红染色，100×) Fig.2　The histological observation of bulbourethral gland from Duroc and Meishan boars at different age (Haematoxylin-eosin staining，100×)

A.PSP-Ⅰ；B.PSP-Ⅱ，不同小、大写字母分别表示同一组织不同时期差异显著和极显著(P<0.05；P<0.01)，n=3。**表示同一时期不同组织差异极显著(P<0.01)A.PSP-Ⅰ；B.PSP-Ⅱ，the different upper and lower case letters indicate significant difference (P<0.05) or highly significant difference (P<0.01) between different periods in the same tissue.** indicate highly significant difference between different tissues in the same period (P<0.01)图3　PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ在精囊腺和尿道球腺中的表达Fig.3　Expression level of PSP-Ⅰ and PSP-Ⅱ in seminal vesicle and bulbourethral gland

公猪的尿道球腺为复合型管泡状腺体，周围被致密的结缔组织包围，在上皮细胞中分布有大量的分泌颗粒，分泌颗粒中含有大量的中性和羧酸化粘多糖以及少量的硫酸化粘多糖，其分泌物在射精之前释放，具有清除尿道和润滑阴道的作用，而糖复合物在精子的代谢过程中发挥重要的作用[10，22-23]。本研究显示270日龄杜洛克公猪的尿道球腺腺泡较同日龄梅山公猪的大，而梅山公猪随着性成熟腺小叶增大，腺泡明显增多，大而多的腺泡含有更多的上皮细胞，故而有更多的分泌颗粒存在，有利于精子的代谢和存活，这也为两品种在有关性状方面的差异提供了基础。

公猪精浆中80%～90%的蛋白是由精囊腺上皮细胞分泌的，而这些蛋白在雌性生殖管道中对精子起保护作用[17]。而PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ蛋白占猪精囊腺蛋白的50%以上，主要是由精囊腺上皮分泌，且能够提高成熟精子的生存力和能动性[7，24-25]。本研究中PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ的 mRNA在精囊腺中的高表达更进一步支持了该异质体的主要来源。而PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ在270日龄比75日龄表达量更高，说明公猪性成熟阶段精囊腺上皮及尿道球腺分泌PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ的能力显著增强，从而可能导致性成熟梅山公猪精子存活率和能动性高于75日龄的梅山公猪。F.Centurion等[26]研究也表明纯化的PSP-Ⅰ/PSP-Ⅱ二聚体对高倍稀释的精子具有保护作用，在体外生理温度下，该复合物能在5 h内维持精子的活力、运动能力和线粒体的活性。

综上表明，270日龄杜洛克公猪精囊腺腺泡上皮有更多的黏膜褶皱，扩大了分泌面积，使得黏膜泡内分泌物增多，也增强了排出分泌物的能力。且杜洛克公猪的尿道球腺腺泡上皮细胞可释放更多的分泌物。较多的精囊腺和尿道球腺分泌物会增加精浆量，提高精子代谢率和在雌性生殖道内的存活率。而精浆蛋白PSP-Ⅰ/PSP-Ⅱ在性成熟的公猪精囊腺上皮及尿道球腺中的高表达可能在精子的代谢和活力维持等生理过程中发挥重要作用，全面了解PSP-Ⅰ/PSP-Ⅱ的功能，对于精液体外保存和提高猪的受胎率与体外受精成功率具有重要意义。

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(编辑程金华)

Histological Comparison and mRNA Expression Analysis of Porcine Seminal Protein on Accessory Glands of Duroc and Meishan Boars

DING Hai-sheng1，XU De-quan1，2，3，LUO Yan1，LIU Min1，2*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China；2.KeyLaboratoryofSwineGeneticsandBreedingofAgriculturalMinistry，Wuhan430070，China；3.TheCooperativeInnovationCenterforSustainablePigProduction，Wuhan430070，China)

In order to assess the histological features of the vesicular gland and bulbourethral gland，and the mRNA expression of porcine seminal protein in 270-day-old Duroc and 75-，270- day-old Meishan boars，the paraffin sections with HE staining were performed and observed under light microscope，and quantitative real-time PCR was also used.Increased glandular lobules and decreased interlobular connective tissues were found in the vesicular glands of 270-day-old Meishan boars compared to those of 75-day-old Meishan boars.More acinus mucosal folds and interlobular connective tissues were found in the vesicular glands of 270-day-old Duroc boars than those of 270-day-old Meishan boars.The bulbourethral glands were composed of multiple lobules separated by connective tissue，and dense acini with small lumens were found.When Meishan boars reached adult age，the enlarged glandular lobules and decreased interlobular connective tissues were observed in the bulbourethral glands.In addition，larger glandular lobules，smaller acini and less interlobular connective tissues were observed in the bulbourethral glands of 270-day-old Meishan boars than those of 270-day-old Duroc boars.PSP-Ⅰ andPSP-Ⅱ were expressed highly in seminal vesicles，but there was no significant difference between the mature Duroc and Meishan boars (P>0.05).With advancing age，the mRNA expression level ofPSP-Ⅰ andPSP-Ⅱ increased significantly in Meishan boars (P<0.05).Overall，more acinus mucosal folds in vesicular glands and larger acini in the bulbourethral glands of Duroc boars increased the epithelial surface area available for secretion and led to an increase in the semen volume and the rate of sperm metabolism and survival.Moreover，high expression ofPSP-Ⅰ andPSP-Ⅱ in mature boars may play a role in some physiological processes，such as maintaining sperm metabolism and motility.

boar；accessory glands；histology；PSP-Ⅰ；PSP-Ⅱ

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.024

2016-01-29

中央高校基本科研业务费专项资金(2662015PY014；2662015PY192；26620015PY108)；湖北省农业科技创新课题(2011-720)；国家科技支撑计划(2014BAD20B01)；国家自然科学基金(31201764)；973项目(2014CB138500)；湖北省自然科学基金(2015CFA101)；武汉市青年科技晨光计划(2014070404010204)

丁海生(1987-)，女，甘肃会宁人，博士生，主要从事动物分子生物学研究，E-mail: dinghs123@163.com

刘敏，博士，副教授，E-mail:liumin23@mail.hzau.edu.cn；Tel: 027-87282091

S852.16+2

A

0366-6964(2016)08-1714-06