瑞香狼毒内生真菌的分离与鉴定

王　欢，路　浩，郭亚洲，冯　柯，耿朋帅，赵宝玉

(西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100)



瑞香狼毒内生真菌的分离与鉴定

王欢，路浩，郭亚洲，冯柯，耿朋帅，赵宝玉*

(西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100)

为探明瑞香狼毒(Stellerachamaejasme)内生真菌的种类及其种属分布特点，进一步揭示瑞香狼毒内生真菌与毒性物质合成、化感作用以及抗逆性形成之间的相互关系，作者对采自4省5个地区瑞香狼毒的茎、叶、花部位进行内生真菌的分离和纯化，通过形态学和分子生物学方法鉴定种属。结果表明，瑞香狼毒中共分离到21株内生真菌，19株菌分属7纲8目9科8 属，2株未鉴定种属，所有从瑞香狼毒分离到的内生真菌中链格孢属(Alternariasp.)8株，占总分离菌株的42%，为瑞香狼毒的优势菌株，除1株粪壳菌纲(Sordariomycetessp.)和8株链格孢属(Alternariasp.)外，其余菌属均首次从瑞香狼毒中分离得到。

瑞香狼毒；内生真菌；分离；鉴定

瑞香狼毒(StelleraChamaejasme)俗称断肠草、馒头花、红火柴头等，属瑞香科狼毒属多年生草本植物，在中国主要分布于东北、华北、西北及西南的草甸草地、典型草地、高寒草地以及荒漠草地[1]。一般情况下，在适度放牧的草地，瑞香狼毒在草地植物群落中以偶见种或伴生种存在，而在放牧过度的退化草地常成为优势种。瑞香狼毒全草有毒，其主要毒性成分为黄酮类化合物，如狼毒素、异狼毒素等，人接触后会发生过敏性皮炎，家畜误食后产生腹痛、腹泻、卧地不起、全身痉挛等症状，严重时虚脱或惊厥死亡[2]。宋晓平等[3]用瑞香狼毒中的黄酮类化合物对小鼠进行急性攻毒试验，发现小鼠肝、肾和心肌等发生不同程度的病变。

植物内生真菌是一定阶段或全部阶段寄生于健康植物器官和组织内部的真菌，普遍存在各种植物中。植物内生真菌能够产生多种次级代谢产物，包括抗生素、杀虫剂、植物生长调节剂[4]和抗肿瘤化合物等多种活性物质。有学者从银杏、杜仲等植物中分离到了多种能产生黄酮类化合物的内生真菌[5-6]。虽然杨国栋[7]和H.Jin[8]等从瑞香狼毒中分离得到了一些子囊菌门和担子菌门的内生真菌，但有关瑞香狼毒内生真菌的种属分布特点及其多样性研究还鲜有开展。而且如前所述，瑞香狼毒的主要化学毒性成分也是黄酮类化合物，但是这些黄酮类化合物是由瑞香狼毒自体产生，还是其内部(与银杏和杜仲等植物相似)也具有产黄酮类化合物的内生真菌，目前尚未见报道。据此，作者对采自不同地区的瑞香狼毒内生真菌进行分离鉴定，旨在阐明瑞香狼毒内生真菌的种类及其种属分布特点，以期为进一步探究瑞香狼毒中所含黄酮类化合物的生成与其内生真菌种属之间的关系，以及瑞香狼毒的化感毒性和抗逆性研究提供实验基础和理论依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1植物材料瑞香狼毒植物样品2015年6—8月间采自甘肃肃南县、甘肃天祝县、青海门源县、山西阳城县和陕西旬邑县，样品采集地信息见表1。现场采集的瑞香狼毒样品放在装有变色硅胶的自封袋中保存备用。

表1瑞香狼毒植物材料信息与内生真菌分离结果

Table 1Plants information ofStellerachamaejasmeand isolation results of endophytic fungi

地点Location地理位置Geographicsites海拔Latitude分离部位Planttissue菌株编号Isolatesnumber甘肃肃南县Sunan,GansuN38°29',E100°24'2500m茎,叶,花Stem,leaf,flowerSC1L1-1,SC1L6-1,SC3S6-1,SC4L3-1,C5F2-1甘肃天祝县Tianzhu,GansuN36°58',E103°07'2600m茎StemSC5S1-1青海门源县Menyuan,QinghaiN37°57',E101°24'2700m叶,花Leaf,flowerSC6F3-1,SC6F5-1,SC6L3-1,SC8L3-1山西阳城县Yangcheng,ShanxiN3520',E112°13'1680m叶LeafSY1L2-1,SC16L4-1,SC16L5-1陕西旬邑县Xunyi,ShaanxiN3503',E108°32'1690m茎,叶,花Stem,leaf,flowerSC10L2-1,SC12S1-1,SC13L2-1,SC13L5-1,SC13L5-2,SC13F1-1,SC13S1-1,SC15L2-1

1.1.2培养基PDA双抗培养基：马铃薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，琼脂10 g·L-1、20 g·L-1。灭菌后的PDA培养基按100 IU·mL-1分别加入青霉素和链霉素。

1.1.3试剂与仪器设备75%酒精，次氯酸钠溶液，CTAB提取液，氯仿，异戊醇，无水乙醇，TAE(Tris，Na2EDTA·2H2O，乙酸)，琼脂糖，2×Taq Master Mix(赫特生物技术公司)，10×Loading buffer(TaKaRa)，VL2000 marker(TaKaRa)，真菌特异性引物ITS1和ITS4，ITS1序列：CCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4序列：TCCTCCGCTTATTGATATGC(南京金斯瑞)，冰箱(新飞 BCD-213KA)，电热恒温培养箱(天津泰斯特DH4000A，精宏)，超净工作台(AIR TECH)，冷冻离心机(SIGMA 3K15)，PCR仪(Bio-Rad)，全自动凝胶成像系统(SYNGENE)。

1.2方法

1.2.1内生真菌的分离采用组织块表面消毒法进行瑞香狼毒内生真菌的分离[9-10]。具体方法如下：将瑞香狼毒植物样品用自来水反复冲洗干净，用灭菌蒸馏水浸泡，至植物组织水饱和复原。选择75%酒精和2%次氯酸钠作为表面消毒剂，用75%酒精处理30～60 s，灭菌蒸馏水漂洗2次，2%次氯酸钠处理1.5～3 min，灭菌蒸馏水漂洗3次。消毒后的植物用剪刀剪成5 mm×5 mm×5 mm的组织块，置于培养基上培养7～15 d，培养温度28 ℃，每2 d观察一次，观察植物组织创口边缘是否有菌丝生长。试验中需设立3个对照，以保证所分到的真菌属于植物内生真菌。一是超净工作台无菌检测，选择一含有培养基的平皿，分离过程中将其敞口放于工作台。二是组织块表面无菌检测，将表面消毒过的样品不经剪切放置在PDA培养基上。三是灭菌蒸馏水无菌检测，将最后一次漂洗样品的蒸馏水均匀涂抹在PDA培养基上。将以上3个培养皿与放置组织块的平皿同时置于培养箱进行培养，3个培养皿中均无真菌生长则说明分离出来的是瑞香狼毒内生真菌。

1.2.2内生真菌的纯化与保存组织块边缘有菌丝生长时，用接种针挑取边缘菌丝接种至新的PDA培养基，待菌落生长至一定大小，重复以上操作2次，直至得到纯化的内生真菌。将纯化的内生真菌接种至PDA斜面培养基，置于培养箱中，28 ℃进行培养，待真菌长满斜面后，取出放于冰箱，4 ℃保存。每3个月对试管中的内生真菌进行活化，将试管中的真菌接种至PDA培养基，培养到一定大小，再次进行菌种保存。

1.2.3内生真菌的鉴定结合传统的形态学鉴定方法与分子生物学鉴定方法对瑞香狼毒内生真菌进行鉴定[11]。

1.2.3.1形态学鉴定：观察PDA培养基上生长的菌落，记录真菌生长的快慢，菌落的形状，菌丝的形态，有无色素产生等。采用插片培养法，在真菌生长的对数期，在菌落边缘以45°斜插盖玻片，使菌丝沿盖玻片生长直至覆盖整个盖玻片，取出盖玻片，显微镜下观察菌丝的颜色，孢子形态，产孢结构以及是否有横隔。结合菌落形态和菌丝显微形态，参照《真菌鉴定手册》对分离出的内生真菌进行初步鉴定。

1.2.3.2分子生物学鉴定：基于rDNA-ITS区的序列多态性确定内生真菌的种属[12]。基本原理是提取真菌的DNA，通过聚合酶链式反应扩增ITS1、5.8S rDNA和ITS2区，琼脂糖凝胶电泳检测目的片段，出现500 bp左右的条带即为阳性，说明目的片段扩增成功。

内生真菌总DNA的提取：采用改良的CTAB法提取内生真菌的总DNA[13]。真菌铺满PDA培养基后，取得菌丝并称重，取50 g用于提取DNA。将菌丝放于1.5 mL离心管，加入液氮充分研磨，研磨后的菌丝中加入60 μL CTAB提取液(65 ℃预热)，离心管使用封口膜封口，放于水浴锅中，65 ℃加热45～60 min，间隔摇晃3次。加入600 μL氯仿和异戊醇混合液(576∶24)，摇晃均匀后，12 000 r·min-1离心5 min，取离心后的上清液，重复以上步骤，直至两相间澄清。吸取最后一次离心的上清液至2 mL的离心管中，加入900 μL无水乙醇与60 μL 3 mol·L-1乙酸钠(pH=6)，混匀后放于冰箱-20 ℃，沉淀1 h以上或过夜。12 000 r·min-1离心5 min，弃上清。沉淀用无水乙醇(-20 ℃预冷)清洗2～3次，挥干乙醇。加适量ddH2O溶解沉淀，放于冰箱-20 ℃保存。

目的片段的扩增：选择ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)真菌特异性引物，扩增真菌核糖体RNA基因的ITS1、5.8S rDNA和ITS2区。取5 μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用成像系统观察结果并拍照，将阳性结果测序(上海桑尼生物科技有限公司)。

1.2.3.3系统发育树构建：测序结果提交至美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)的BLAST子网，寻找具有同源性的序列，将所测序列与同源性高的序列使用软件Mega5.1进行序列对齐，进而使用邻接法(Neighbor-joining)构建系统发育树，自展法检测发育树，分析发育树以确定真菌种属。

2　结　果

2.1瑞香狼毒内生真菌的分离

从来自4省5个地区的瑞香狼毒中进行瑞香狼毒茎、叶、花三个部位内生真菌的分离，通过形态学观察，根据各菌株菌落形态特征，将疑似同种属的菌株合并，合并后的菌株共有21株，其中叶中分离到的最多，共13株，其余有4株来自茎，4株来自花(表1)。

2.2瑞香狼毒内生真菌的鉴定

观察记录21株真菌的菌落形态，是否产生色素，菌丝显微形态(表2，图1)，初步鉴定SCL6-1、SC16L5-1、SC15L2-1、SC13S1-1、SC13L5-1、SC13L2-1、SC12S1-1、SC10L2-1共8株菌属于链格孢属，其余各菌株形态差异大，通过分析5.8S rDNA-ITS区序列进行分子生物学鉴定。除未鉴定的2株菌，瑞香狼毒中分离的其余19株菌分属于真菌的担子菌亚门，半知菌亚门，子囊菌门的子囊菌亚门和盘菌亚门，共7纲8目9科8 属。已鉴定的19株菌中，1株仅确定到纲，为子囊菌门盘菌亚门粪壳菌纲(Sordariomycetessp.)，1株确定到科，子囊菌亚门核菌纲炭角菌目毛孢壳科(Coniochaetaceaesp.)。11株菌确定到属，其中8株是链格孢属(Alternariasp.)，枝孢属(Cladosporiumsp.)2株，戴氏霉属(Taifanglaniasp.)1株。6株确定到种，分别是柄孢壳属Podosporavesticola、核座孢属Plenodomushendersoniae、光黑壳属Preussiafuniculata和Preussiaintermedia、球盖菇属Leratiomyceslaetissimus、茎点霉属Phomamoricola。由图2可见，链格孢属(Alternariasp.)是瑞香狼毒内生真菌的优势菌属，其余菌属的菌株数目相当，均为1～2个。瑞香狼毒中分离出的19株菌株序列已提交至GenBank，登入号信息见表2。

表2瑞香狼毒内生真菌形态学特征、种属和GenBank登入号

Table 2Morphological characteristics，genus and species and accession number of endophytic fungi fromStellerachamaejasme

菌株编号Strainnumber种属Genusandspecies登入号Accessionnumber形态学特征MorphologicalcharacteristicsSC1L1-1Cladosporiumsp.KT235907菌丝绿色、质密、匍状生长,菌落中间凸四周扁平,背面菌落绿色、边缘白色、全圆,生长速度3.3mm·d-1Green,compacthyphaecreep.Thecolonyisprotuberantinthemiddleandflataround.Thecolonylooksgreen,whiteintheedgefromthebackandshowsawholecir-cle.Growthrateis3.3mm·d-1SC1L6-1,SC10L2-1,SC12S1-1,SC13L2-1,SC13S1-1,SC13L5-1,SC15L2-1,SC16L5-1Alternariasp.KT235908菌丝绿色、质密、匍状生长,菌落中间凸四周扁平,背面菌落白色、边缘黑色、全圆,生长速度11mm·d-1Green,compacthyphaecreep.Thecolonyisprotuberantinthemiddleandflataround.Thecolonylooksgreen,blackintheedgefromthebackandshowsawholecir-cle.Growthrateis11mm·d-1SC3S6-1PreussiaintermediaKT235913菌丝白色、质密、匍状生长,菌落扁平,背面菌落黄色、锯齿状、边缘白色泛黄,生长速度0.075mm·d-1Green,compacthyphaecreep.Thecolonyisflat.Thecol-onylooksyellow,whitewithyellowintheedgeandserra-tedfromtheback.Growthrateis0.075mm·d-1SC4L3-1PodosporavesticolaKT235909菌丝米白、质密、匍状生长,菌落中间凸四周扁平,背面菌落白色、全圆、边缘白色泛浅绿,生长速度0.33mm·d-1Beige,compacthyphaecreep.Thecolonyisprotuberantinthemiddleandflataround.Thecolonylookswhite,whitewithlightgreenintheedgeandshowsawholecir-cle.Growthrateis0.33mm·d-1SC5S1-1PlenodomushenersoniaeK235910菌丝白色、质密、辐状生长,菌落半球形,背面菌落黑色、全圆、边缘白色,生长速度0.05mm·d-1White,compacthyphaegrowradially.Thecolonyishemi-spheric.Thecolonylooksblack,whiteintheedgeandshowsawholecircle.Growthrateis0.05mm·d-1SC5F2-1LeratiomyceslaetissimusKT235914菌丝白色、质密、匍状,菌落不规则圆形,背面菌落白色、不规则圆形,生长速度0.02mm·d-1White,compacthyphaecreep.Thecolonyisirregularcir-cle.Thecolonylookswhiteinthebackandshowsanir-regularcircle.Growthrateis0.02mm·d-1

(转下页 Carried forward)

图1　瑞香狼毒内生真菌菌落与菌丝形态(400×)Fig.1 Hyphae and Colony characteristics of endophyic fungi from Stellera chamaejasme (400×)

图2　邻接法构建的基于5.8S rDNA-ITS序列的系统发育树Fig.2　Phylogenetic tree constructed with the programme neighbor-joining based on the 5.8S rDNA-ITS sequences

2.3内生真菌遗传进化分析

对分离出的19株内生真菌与Blast上具有与其5.8S rDNA-ITS区相似性序列的真菌，以5.8S rDNA-ITS区为对象，通过序列对齐，邻接法构建系统发育树，得到图2所示系统发育树。分析发育树可见，瑞香狼毒内生真菌分属于I、II、III 3大类群，3个类群自展系数均达到99%以上。类群III仅包含1株菌SC5F2-1，且与其他菌株亲缘关系较远。类群II可分为C和D两个小类群，其中D中的3株菌亲缘关系较近，都属于子囊菌亚门。类群I在3个类群中菌株数量最多，除链格孢属的8株菌外，其余2株菌都属于半知菌亚门腔孢纲球壳孢目球壳孢科。

3　讨　论

虽然H.Jin等[8]从瑞香狼毒中分离到41种，其中40个属于子囊菌门，1个属于担子菌门，杨国栋[7]对分离自瑞香狼毒的68株内生真菌进行鉴定，发现其分属于10个属(群)。但有关瑞香狼毒内生真菌种属多样性及其分布特点的研究还鲜有报道。本试验中从瑞香狼毒中共分离到21株内生真菌，优势菌属为链格孢属(Alternariasp.)，与H.Jin和杨国栋等的报道一致，有10种是从瑞香狼毒中首次分离到的最新菌属。作者选择了采自4省5个地区的瑞香狼毒进行内生真菌的分离，其中甘肃肃南县分离到内生真菌Cladosporiumsp.、Alternariasp.、Preussiaintermedia、Podosporavesticola和Leratiomyceslaetissimus，甘肃天祝县分离到Plenodomushenersoniae，青海门源分离到Coniochaetaceaesp. 和Sordariomycetessp.，山西阳城分离到Taifanglaniasp.、Phomamoricola和Alternariasp.，陕西旬邑分离到Preussiafuniculata。不同地区分离到的内生真菌，除链格孢属(Alternariasp.)从采自甘肃肃南和山西阳城的瑞香狼毒中都分离到，其余内生真菌在5个地区分布的种类各不相同，这可能是由于不同地区瑞香狼毒中的内生真菌种类存在差异，说明瑞香狼毒内生真菌的种属分布有区域特异性。试验选择的2种琼脂比例的PDA培养基上分离出的瑞香狼毒内生真菌种类数目相差不多，10 g·L-1的培养基上分离到11株，琼脂比例为20 g·L-1时，分离到10株，但琼脂量少时，组织块上长出内生真菌的时间为3～10 d，而琼脂量大时，得到内生真菌的时间稍微有所增加，为7～15 d。试验表明在进行瑞香狼毒内生真菌分离时，选择琼脂为10 g·L-1的培养基分离效率比琼脂为20 g·L-1的要高。李姝诺等[14]从越橘中分离到能产生黄酮的细链格孢(Alternaria.tenuissima)，产生的黄酮类化合物具有与植物成分相似的结构。本试验从瑞香狼毒中分离到了其优势内生真菌——链格孢属(Alternariasp.)，但其是否能产生狼毒素等黄酮类化合物尚有待进一步研究。

4　结　论

从采自4省5地区的瑞香狼毒中共分离到21株菌，属于7纲8目9科8 属，分别是Cladosporiumsp.，Alternariasp.，Preussiaintermedia，Podosporavesticola，Plenodomushenersoniae，Leratiomyceslaetissimus，Coniochaetaceaesp.，Pyrenophorateres，Sordariomycetessp.，Preussiafuniculata，链格孢属(Alternariasp.)是瑞香狼毒内生真菌的优势菌属。

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(编辑白永平)

Isolation and Identification of Endophytic fungi fromStellerachamaejasme

WANG Huan，LU Hao，GUO Ya-zhou，FENG Ke，GENG Peng-shuai，ZHAO Bao-yu*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

To explore the classes and distribution characteristics of endophytic fungi inStellerachamaejasmeand further explain the connection between fungal endophytes and the toxin synthetism，allelopathy and stress resistance formation，the endopytic fungi in the stems，leaves and flowers ofStellerachamaejasmewere isolated，purified and identified through morphological and molecular methods.Among 21 isolates obtained fromStellerachamaejasme，19 strains were identified to belong to 8 genera，9 families，8 orders and 7 classes，and 2 strains were unidentified.Eight strains of fungi were identified asAlternariasp.，and take 42% of all strains isolated and were the dominant fungal.Except for 1Sordariomycetessp.and 8Alternariasp.，other species were all first isolated fromStellerachamaejasme.

Stellerachamaejasme；endophytic fungi；isolation；identification

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.022

2016-01-22

农业部“十二五”公益性行业(农业)科研专项(201203062)

王欢(1990- )，女，山西运城人，硕士生，主要从事动物中毒病与毒理学研究，E-mail: wah2318@163.com

赵宝玉(1964-)，E-mail:zhaobaoyu12005@163.com

S859.87

A

0366-6964(2016)08-1696-08