热应激造成奶牛乳腺上皮细胞损伤并影响乳合成相关载体的基因表达

权素玉，张源淑，卜登攀

(1.南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室，南京 210095； 2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193； 3.CAAS-ICRAF农用林业与可持续畜牧业联合实验室，北京 100193； 4.东北农业大学 食品安全与营养协同创新中心，哈尔滨 150030)



热应激造成奶牛乳腺上皮细胞损伤并影响乳合成相关载体的基因表达

权素玉1，2，张源淑1*，卜登攀2，3，4*

(1.南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室，南京 210095； 2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193； 3.CAAS-ICRAF农用林业与可持续畜牧业联合实验室，北京 100193； 4.东北农业大学 食品安全与营养协同创新中心，哈尔滨 150030)

本试验以奶牛乳腺上皮细胞为模型，旨在寻找热应激下调奶牛泌乳功能的相关因素。42 ℃高温处理奶牛乳腺上皮细胞0、0.5、1、1.5、2、4、8 及12 h，检测其对细胞活率，线粒体膜电位，热休克分子及蛋白基因、氧化应激相关基因以及氨基酸和葡萄糖转运载体基因表达的影响。结果显示，不同时间热处理显著降低乳腺上皮细胞活率(P<0.05)，损伤细胞线粒体膜电位。HSP27基因表达显著下降(P<0.05)，HSP70基因表达显著上调(P<0.05)，HSP90基因表达在前4 h显著上调(P<0.05)，后恢复至正常水平，HSF-1基因表达在某些时间点显著上调(P<0.05)。氧化应激相关基因Keach样环氧氯丙烷相关蛋白-1 (Keap1)表达无显著变化 (P>0.05)，核因子E2相关因子2 (Nrf2) 表达显著上调(P<0.05)，NAD(P)H脱氢酶醌-1 (NQO1) 表达显著上调(P<0.05)。跨膜氨基酸转运载体SLC7A7基因表达在1 h和4 h显著上调(P<0.05)。葡萄糖转运载体GLUT1及GLUT8基因表达显著下调(P<0.05)。葡萄糖转运载体GLUT12在热处理0～2 h表达显著上调，4～12 h显著下调(P<0.05)。热应激能够显著降低奶牛乳腺上皮细胞活率，引起氧化应激，改变热休克蛋白和分子及跨膜转运载体的基因表达。

热应激；牛乳腺上皮细胞；细胞活力；线粒体膜电位；氧化应激；热休克蛋白；跨膜转运载体

热应激(Heat stress)可简单定义为动物机体自身产生的热量或者从外界吸收的热量不能充分散发出去时，机体为了维持体温平衡时的一种状态[1]。已有研究证实，周围环境温度过高引起的热应激不利于奶牛的泌乳、生长和繁殖，其对乳制品行业产生的经济损失尤为严重[2]。热应激不仅显著降低乳产量，而且对乳品质也有很大的影响，基于热应激的强度和持续时间不同，其对乳糖含量[3-4]、乳脂含量[5]、乳蛋白含量的影响也不一致，并且热应激可能影响乳蛋白的合成机制，尤其是β-酪蛋白的合成[6]。

奶牛乳腺上皮细胞对高温(42 ℃)产生快速应激反应，以热休克转录因子HSF(Heat shock transcription factor，HSF) 和热休克蛋白HSP(Heat shock protein，HSP) 基因表达显著改变为标志[7]。Keap1-Nrf2-ARE信号通路介导的II相解毒酶和抗氧化基因的转录是细胞抗氧化机制中最重要的通路[8]，热应激可造成细胞氧化应激损伤，上调Keap1-Nrf2-ARE信号通路及其下游基因HO-1和NQO1的表达[9]。

氨基酸和葡萄糖分别是乳蛋白及乳糖合成的主要前体物，血液中的氨基酸和葡萄糖必须通过特殊的转运系统进入乳腺上皮细胞后才能用于乳蛋白和乳糖的合成，这些转运系统包括氨基酸转运载体SLC1家族、SLC7家族、SLC38家族，SLC43家族及葡萄糖转运载体(Glucose transporter，GLUT) SLC2家族等[10]。目前，虽然鉴定出的氨基酸转运载体数量与日俱增，但其在机体生长发育及乳腺上皮细胞泌乳中的功能研究较少，胡菡等[7]研究发现，高温(42 ℃)处理显著影响奶牛乳腺上皮细胞乳脂肪和乳蛋白合成相关基因mRNA的表达丰度。

本试验采用奶牛乳腺上皮细胞为模型，通过42 ℃高温引起热应激，探讨热应激对细胞活率，热休克蛋白、跨膜氨基酸转运载体、葡萄糖转运载体基因表达的影响，为寻找热应激降低奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的机制提供参考。

1　材料与方法

1.1仪器和试剂

3111型 CO2培养箱(Thermo，美国)，D-37520离心机(Thermo，美国)，4F00318倒 置 显 微 镜(Olympus，日本)，NanoDrop1000(Thermo，美国)，TC10细胞计数仪(Bio-Rad，美国)，EV Eleeh酶标仪(Thermo，美国)，IQ5 荧光定量 PCR 仪(Bio-Rad，美国) 等。

DMEM/F12 培养基(Gibco，美国)，FBS(Gibco，美国)，胰酶(碧云天生物技术研究所，中国)，RNeasy Plus Universal Mini Kit (QIAGEN，德国)，Prime ScriptTMRT reagent Kit With gDNA Erase (TaKaRa，日本)，噻唑蓝(MTT，Sigma，美国)、 二甲基亚砜(DMSO，Sigma，美国)，线粒体膜电位检测试剂盒(碧云天，中国)等。

1.2方法

1.2.1细胞培养及试验设计原代奶牛乳腺上皮细胞由东北农业大学乳品科学教育部重点实验室提供。细胞培养参照H.Hu等[11]的方法。具体如下：细胞培养于含10% FBS 的DMEM/F12 培养基中，培养条件为5% CO2，对照组38 ℃，高温应激组42 ℃。

用培养基悬浮冻存的奶牛乳腺上皮细胞，38 ℃培养3代使其稳定。胰酶消化细胞后以1×104个·mL-1的密度接种到中号培养皿，每皿5 mL细胞悬液。于倒置显微镜观察，待细胞生长至80%～90%后转移至42 ℃分别培养0.5、1、1.5、2、4、8、12 h，以38 ℃培养条件为对照，每个处理3个重复。1.2.2细胞活率检测MTT法检测。将生长旺盛的牛乳腺上皮细胞铺于96孔板，细胞悬液密度为1×105个·mL-1，每孔200 μL，在接种孔的四周每孔加入200 μL培养基，防止“边缘效应”。于38 ℃培养，通过倒置显微镜观察，待细胞基本长满时，置于42 ℃分别培养0、0.5、1、1.5、2、4、8、12 h后加入含0.5 mg·mL-1的MTT培养基，于38 ℃孵育4 h。弃去孔中培养基，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃ 孵育10 min，分别于570 nm，630 nm测其吸光度。每个处理3个重复。细胞活率按如下公式计算[12]：

细胞活率(%)=(热处理组OD570 nm-热处理组OD630 nm)/(对照组OD570 nm-对照组OD630 nm)×100/%。

1.2.3线粒体膜电位检测JC-1是理想的检测细胞线粒体膜电位荧光探针，当细胞线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，产生红色荧光，当膜电位较低时，JC-1为单体，产生绿色荧光，我们用红绿荧光的比例来衡量线粒体膜电位的变化。以38℃培养的细胞作为阴性对照组，42 ℃培养1.5 h的细胞作为试验组(细胞活率检测结果可知，1.5 h热应激细胞活率最低，细胞损伤最严重)，CCCP诱导线粒体膜电位下降的细胞为阳性对照组，检测热应激1.5 h对细胞线粒体膜电位的损伤。

1.2.4细胞相关基因Real-time PCR 检测细胞总RNA提取：采用 RNeasy Plus Universal Mini Kit(QIAGEN，Germany) 提取细胞RNA，所提取RAN用紫外分光光度计Nanodrop 测定浓度，并将其浓度调整至500 ng·μL-1，用于后续反转录。

反转录：采用Prime ScriptTMRT reagent Kit With gDNA Erase (TaKaRa，Japan) 试剂盒进行反转录。反转录总体系为10 μL。反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存，获得cDNA，-20 ℃保存备用。

引物合成：HSF-1、HSP27、HSP70、HSP90、RPS9引物序列参见参考文献[13]。GLUT1、GLUT8、GLUT12引物序列参见参考文献[14]，Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1基因分别参见参考文献[15]和[16]，SLC7A5、SLC7A7、SLC38A2、SLC43A1 的扩增引物由Primer Premier 5.0 设计。所有引物由北京华大基因公司合成，详见表1。

采用ABI 7500 PCR仪进行qRT-PCR 反应，20 μL反应体系中：SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)10 μL，PCR Forward primer 0.8 μL，PCR Reverse primer 0.8 μL，cDNA 2 μL，RNase-free H2O，6 μL，ROX Reference DyeⅡ，0.4 μL。反应条件：第1阶段：95 ℃ 30 s，1 个循环；第2阶段：95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环，然后完成熔解曲线。

以核糖体蛋白R9(RPS9)[12]作为内参基因，2-ΔΔCT[15]法对奶牛乳腺上皮细胞热休克因子HSF-1，热休克蛋白HSP27、HSP70、HSP90，抗氧化基因Keap1、Nrf2、NQO1，葡萄糖转运载体GLUT1、GLUT8、GLUT12，跨膜氨基酸转运载体SLC7A5、SLC7A7、SLC38A2、SLC43A1基因表达进行相对定量分析。

1.2.5数据统计与分析数据经Excel初步整理后，以SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，之后进行Duncan 氏多重比较，结果用“平均值±标准差(mean±SD)”表示，显著水平为P<0.05。

2　结　果

2.1不同时间热处理对奶牛乳腺上皮细胞活率的影响

不同时间热处理对细胞活率的影响结果见图1。由图1可知，不同时间热处理均显著降低了细胞活率。在0～1.5 h细胞活率持续降低，于2 h后开始恢复。推测热应激2 h后细胞逐渐适应高温环境，存活率短期内不再下降。

2.2热应激对细胞线粒体膜电位的影响

热应激对细胞线粒体膜电位的影响见图2。图2中A为阴性对照组，B为热应激组，C为阳性对照组，可看出阴性对照组主要显示红色荧光，表明细胞线粒体膜电位较高，热应激组绿色荧光多于阴性对照组，表明细胞线粒体膜电位降低，细胞损伤，阳性对照组细胞几乎全部损伤，显示绿色荧光。

2.3不同时间热处理对热休克因子(HSF-1)及热休克蛋白(HSPs)基因表达的影响

不同时间热处理对热休克因子(HSF-1)及热

表1引物信息

Table 1The information of primer designed

基因GeneGenBank序列号GenBankaccessionNo.引物序列(5'-3')PrimersequenceHSF-1NM_001076809F:AAAGATCCCCCTGATGCTGAACGACR:CAGTTCGGTGATGTCGGAGATGATGHSP27BT021550F:CGGACGCACCAGACCAGCCAGCATR:GGCTGTGGGCCGGATACCAGTCGCGHSP70X53827F:CTGAACCCGCAGAACACGR:CCTTGGTCTCCCCTTTGTHSP90NM_001079637F:CCAAGTCTGGCACTAAAGR:GAAGACTCCCAAGCATACSCLC7A5NM_174613.2F:GCTCGTCTTCGCCACCTACCR:GCCTTCACGCTGTAACAGTTCASLC7A7NM_001075151.1F:CATGGCGTTGATCTATTTGTR:CCTGTTGGGCTCCTTCCSLC43A1NM_001206598.1F:TGAGACGGATGACCTGAAGCR:GGTGGTCTGACGGACTTGGSLC38A2NM_001082424.1F:AAGCCATTATGCCGATGTR:GGATTCCACTGCCCACARPS9DT860044F:CCTCGACCAAGAGCTGAAGR:CCTCCAGACCTCACGTTTGTTCGLUT1NM_174602F:GTGCTCCTGGTTCTGTTCTTCAR:GCCAGAAGCAATCTCATCGAAGLUT8NM_201528F:AGTGACTGCCCGTCCTTGCTR:TGCTGTCCTGGCTCCTGACTGLUT12NM_00101168F:AAGATGCTGCCCACCTACGR:TCGCTTCCCATTCCTCACAKeap1NM_001101142.1F:TCACCAGGGAAGGATCTACGR:AGCGGCTCAACAGGTACAGTNrf2NM_001011678F:CCCAGTCTTCACTGCTCCTCR:TCAGCCAGCTTGTCATTTTGHO-1NM_001014912F:AGACTTGGCTCCCACCAAR:AGGTGCCTGGGAGAGGACNQO1NM_001034535F:CGGAATAAGAAGGCAGTGCTR:CCATGGATACCATGCAGAGA

图1　不同时间热处理对细胞活力的影响Fig.1　Effects of different heat treatment time on cell vitality

A.阴性对照；B.热应激组；C.阳性对照组A.Negative control group；B.Heat stress group；C.Positive control group图2　热应激对细胞线粒体膜电位的影响 200×Fig.2　Effects of heat stress on cell mitochondrial membrane potential 200×

休克蛋白(HSPs)基因表达的影响见表2。由表2可知，随着热应激时间延长，HSP27表达量持续并显著降低(P<0.05)。HSP70的基因表达显著上升，2 h其表达量达到峰值(P<0.05)。HSP90在0.5～4 h一直维持较高水平的表达量(P<0.05)，8 h回落到基础水平。HSF-1在热应激情况下基因表达升高显著(P<0.05)。

表2不同时间热处理对热休克因子及热休克蛋白基因表达的影响

Table 2Effects of different heat treatment time on the gene expression of heat shock factor and heat shock protein

项目Item处理时间/hTreatmenttime00.511.524812HSP271.00±0.12a0.50±0.13c0.35±0.04c0.49±0.13c0.53±0.28b0.35±0.06c0.38±0.09c0.28±0.09cHSP701.01±0.15d57.80±4.48c133.89±13.33b156.22±19.53ab188.86±31.89a74.62±21.27c14.68±7.03d59.27±55.26cHSP901.01±0.17b1.82±0.16a1.87±0.15a1.95±0.27a1.75±0.49a2.07±0.14a1.07±0.28b0.72±0.05bHSF-11.03±0.28c3.18±1.29ab3.38±0.59ab1.81±0.13bc3.36±0.10ab2.39±1.01ab1.13±0.15c3.30±0.53ab

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同

Values in the same row with the same or no small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)，while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).The same as below

2.4不同时间热处理对抗氧化基因表达的影响

不同时间热处理对抗氧化基因表达的影响见表3。由表3可知，Keap1基因在热应激条件下表达量无显著差异(P>0.05)。Nrf2基因表达显著上调，在高温2 h表达量最高，随后开始下调，至8 h回落到基础水平(P<0.05)。NQO1基因表达显著上调，在高温1 h表达量最高(P<0.05)，随后开始下降，但在高温12 h内始终高于基础水平。

表3不同时间热处理对抗氧化基因表达的影响

Table 3Effects of different heat treatment time on the gene expression of antioxidant

项目Item处理时间/hTreatmenttime00.511.524812Keap11.01±0.210.77±0.070.83±0.070.84±0.171.07±0.200.76±0.000.84±0.081.13±0.71Nrf21.01±0.18c1.10±0.34c1.11±0.16bc1.28±0.52bc2.59±0.67a1.70±0.28b0.91±0.16c1.35±0.34bcNQO11.06±0.46c2.01±0.40ab2.36±0.29a1.56±0.10bc1.45±0.23bc1.56±0.06bc1.42±0.60bc1.40±0.60bc

2.5不同时间热处理对跨膜氨基酸转运载体基因表达的影响

不同时间热处理对跨膜氨基酸转运载体基因表达的影响见表4。由表4可知，高温处理显著降低跨膜氨基酸转运载体SLC7A5基因的表达(P<0.05)，SLC7A7基因在1 h及4 h表达量显著升高(P<0.05)。SLC38A2及SLC43A2基因表达在热应激条件下无显著差异(P>0.05)。

表4不同时间热处理对氨基酸转运载体基因表达的影响

Table 4Effects of different heat treatment time on the gene expression of transmembrane amino acid transporters

项目Item处理时间/hTreatmenttime00.511.524812SLC7A51.00±0.10a0.86±0.06b0.70±0.07c0.56±0.03d0.51±0.17d0.55±0.02d0.15±0.04e0.11±0.00eSLC7A71.01±0.20c1.07±0.09c1.12±0.14b0.91±0.02c0.73±0.15c1.66±0.69a0.75±0.10c0.73±0.02cSLC38A21.00±0.071.96±1.581.34±0.864.03±3.143.67±0.112.95±0.503.29±0.942.67±0.39SLC43A21.00±0.081.13±0.021.38±0.341.49±0.011.40±1.051.09±0.281.31±0.181.67±0.16

2.6不同时间热处理对葡萄糖转运载体基因表达的影响

不同时间热处理对葡萄糖转运载体基因表达的影响见表5。由表5可知，GLUT1基因在热应激4～12 h表达量均显著下调(P<0.05)。GLUT8基因从0.5 h即开始显著下调，至8～12 h表达量达到最低(P<0.05)。GLUT12基因表达在0.5～2 h显著上调，4～12 h显著下调(P<0.05)。

表5不同时间热处理对葡萄糖转运载体基因表达的影响

Table 5Effects of different heat treatment time on the gene expression of glucose transporters

项目Item处理时间/hTreatmenttime00.511.524812GLUT11.01±0.20a0.86±0.19ac0.92±0.11a0.87±0.21ab0.73±0.24ad0.59±0.15bcde0.41±0.18e0.41±0.12eGLUT81.01±0.19a0.49±0.21cde0.49±0.20ce0.49±0.10bde0.85±0.04ab0.58±0.24bc0.19±0.13f0.22±0.03defGLUT121.01±0.17cdf1.61±0.06bc1.82±0.24b2.52±0.91a1.75±0.37b0.60±0.19de0.18±0.13e0.39±0.11def

3　讨　论

细胞暴露于高温环境会引起细胞功能一系列异常现象，包括广泛的蛋白合成抑制、蛋白结构和功能的改变、细胞骨架重排造成的细胞形态学变化、代谢转变、细胞膜流动性的改变以及细胞增殖受阻[17]。L.Li等[[18]将奶牛乳腺上皮细胞于40.5 ℃高温水浴制造热应激，30 min后于37 ℃恢复3～24 h，表明细胞活率在6 h达到最低，而后逐渐开始增加，于18～24 h恢复到正常水平。胡菡等[7]将奶牛乳腺上皮细胞置于42 ℃高温成功制造了热应激模型，本试验参照其方法，将奶牛乳腺上皮细胞置于42 ℃高温，复制热应激模型。结果显示，在0～1.5 h细胞活率持续降低，于2 h后开始恢复，但均显著低于正常水平，说明热应激2 h后细胞逐渐适应高温环境，存活率短期内不再下降。J.Du等[19]通过40 ℃ 1 h成功制造了奶牛乳腺上皮细胞热应激模型，表明高热可通过降低线粒体膜电位触发细胞凋亡及坏死途径。本试验证明，高温1.5 h可降低细胞线粒体膜电位，后者触发的细胞凋亡途径可能是导致细胞活率显著降低的重要原因。

细胞热应激反应是一个高度保守的蛋白激活和基因表达改变级联反应，该网络中的基因表达受到HSF的调节[20]。HSF家族普遍存在于真菌、果蝇、禽类、人类等多种生物体内，且具有广泛的同源性，被证明是细胞温度升高的最重要的第一反应物[21]，转录因子与细胞对热应激的反应相协同，影响包括HSP在内的一系列基因的表达[22]。奶牛HSF1基因定位于14号染色体，由525个氨基酸组成，包括DNA结合域、三聚区域、调节域和转录活化域4部分[23]。HSP是在各种应激条件下产生的分子伴侣，在细胞保护中的中心作用体现在其对抗高温引起的循环休克和脑缺血[24]。

泌乳期奶牛对高温尤其敏感，R.J.Collier等[25]以奶牛乳腺上皮细胞为模型证明，在高温开始阶段(42 ℃)，牛乳腺上皮细胞形态发生变化(导管分支退化)，细胞生长减弱，随后，基因转录与蛋白合成及细胞代谢下降，在这一模型系统中，HSP70基因维持了4 h的高表达，8 h后恢复基础水平，标志着耐热信号的终止和凋亡相关基因的激活。随后，R.J.Collier等[26]明确提出提高或者延长热休克应答能够改善细胞对高温的耐受能力。与此相一致，K.Dokladny等[27]发现MDCK上皮细胞过表达HSP70同样可以提高热耐受。本试验证明，42 ℃高温处理可显著提高HSP70的基因表达，并在2 h其表达量达到峰值，随后表达量逐渐降低，但始终显著高于基础水平。HSP90在0.5～4 h一直维持较高水平的表达量，8～12 h回落到基础水平。HSP27随着热应激时间延长，其表达量显著降低。HSF-1在热应激情况下基因表达总体升高。HSP70在1～2 h之内表达量升高至百倍，HSP90在1～4 h表达量增加1倍左右，而细胞活率在1.5～2 h后不再降低，说明随着高温时间延长，其耐热能力增强，细胞死亡率降低，推测HSP70和HSP90高表达提高了细胞对于高温的耐受能力。胡菡等[7]的试验中，热应激0～24 h 对HSP27基因的表达无显著影响，而本试验中HSP27随热应激延长表达量持续下降，可能是由于所选用细胞代数不同，其对高温的耐受程度不同所造成，但其降低的具体原因还有待深入研究。

热应激会引起动物体温上升，体温升高会影响机体内代谢酶的活性，使机体代谢率升高，高代谢率会增加自由基的产生，自由基会和许多生物大分子反应，如脂质蛋白质和核酸，过多的自由基会打破机体氧化和抗氧化的平衡系统，造成脂质的过氧化，引起蛋白质和DNA的损伤，导致氧化应激的产生[28]。宋小珍等[29]研究发现，热应激导致肉牛机体产生了明显的氧化损伤。Nrf2是调控氧化应激基因表达的关键转录因子，正常生理条件下，Keap1与Nrf2相互结合，抑制Nrf2从胞浆进入胞核内激活下游ARE信号。当细胞发生氧化应激时，Keap1与Nrf2解偶联，Nrf2转移入核内，与基因中的小Maf 蛋白结合成异二聚体后识别并结合ARE，启动下游抗氧化蛋白基因的转录，提高细胞抗氧化能力[30]。本试验发现，Nrf2及下游抗氧化基因NQO1随着热应激时间延长，其表达量均有不同程度的升高，推测高温造成了奶牛乳腺上皮细胞氧化应激，激活了Keap1-Nrf2-ARE信号通路，使抗氧化基因表达上调。

AA通过几种特殊的转运系统进入乳腺上皮细胞，1985年，C.R.Baumrucker 初步阐明了奶牛乳腺组织中的氨基酸转运载体(Amino acid transporters，AATs) 的功能特性[31]。1998年，基于离子依赖性和底物特异性，至少已鉴定出6个氨基酸转运系统，包括Na+依赖性的A、ASC、XAG，N系统和非Na+依赖性的L和y+系统[32]，形成了6个溶质载体(Solute carrier，SLC)基因超家族：SLC1、SLC6、SLC7、SLC36、SLC38及SLC43家族及一个单羧酸转运蛋白SLC16。特定的氨基酸转运载体不仅能够跨膜运输氨基酸，而且这些氨基酸转运载体能够通过mTORC1影响蛋白代谢[33]。某些氨基酸转运载体还具有“转运感受器(Transceptors)” 的功能，它位于胞内信号上游，能够感受细胞内外氨基酸浓度。J.Pinilla等[34]研究显示，降低细胞氨基酸供给，氨基酸结合到中性氨基酸转运载体SNAT2时，或者氨基酸流经过SNAT2时，可改变SNAT2的构象，从而触发激活mTORC1的层叠信号。因此，氨基酸转运载体在介导氨基酸与mTORC1信号通路及调控蛋白代谢过程中起了重要作用。

SLC7A5编码的氨基酸转运载体LAT1，与SLC3A2编码的4F2hc载体(CD98)相结合形成的双向转运异二聚体可将苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、亮氨酸以及色氨酸等长链氨基酸转运入胞内，同时将谷氨酰胺转运出细胞，该双向转运过程为氨基酸激活mTOR通路的限速步骤[35]，mTOR通路可进一步调控乳蛋白合成过程。中性氨基酸转运载体SNAT2由SLC38A2编码，近期研究表明，SNAT2与LAT1-CD98相偶联，亮氨酸浓度增加后可通过该偶联激活mTOR通路[36]。SLC7A7编码的转运载体可将阳离子氨基酸及一些长链氨基酸转运到胞外，该基因缺乏可导致赖氨酸尿性蛋白不耐受[6]。本试验显示，热应激可显著下调奶牛乳腺上皮细胞SLC7A5基因表达。SLC7A7基因表达在42 ℃高温1.5 h及4 h表达量显著高于对照组。SLC38A2和SLC43A1基因表达受高热处理后基因表达无显著差异 。该结果表明，奶牛乳腺上皮细胞各个家族氨基酸转运载体受高热处理后基因表达变化不一致，推测热应激条件下奶牛乳腺上皮细胞通过影响跨膜氨基酸转运载体基因表达改变其对血液中游离氨基酸的摄取进而改变乳蛋白的合成。

葡萄糖是乳糖合成的重要前体物，是乳中的重要固形物，能够渗透性调节乳产量[37]。葡萄糖转运载体(GLUTs)是广泛存在于哺乳动物细胞膜上的一类功能性蛋白，其主要作用为跨膜运输细胞内外的葡萄糖，其中，GLUT1是乳腺组织中最重要的葡萄糖转运载体，其对于乳腺组织乳糖的合成有重要的意义[13]。怀孕后期至泌乳前期GLUT1、GLUT8、GLUT12基因表达增加5倍到数百倍不等，表明其对乳腺发育及泌乳的维持必不可少[38]。本试验表明，热应激可不同程度降低GLUT1和GLUT8基因的表达量，GLUT12基因表达在热应激0～2 h表达量显著升高，4～12 h显著降低。乳腺上皮细胞转染试验显示，GLUT1和GLUT12表达增加可显著上调SLC1A5、SLC3A2、SLC7A5的基因表达[39]，表明乳腺上皮细胞葡萄糖转运载体表达可影响跨膜氨基酸转运载体的表达。热应激条件下跨膜氨基酸及葡萄糖转运载体基因表达的改变可能与高温造成细胞膜流动性改变，细胞膜重新排列有关[40]，但其具体机制目前尚不明确。

4　结　论

夏季高温持续时间过久引起的热应激给奶牛业造成了巨大的经济损失，尤其严重地影响了奶牛的泌乳性能。本试验以奶牛乳腺上皮细胞为模型，证明热应激可显著降低细胞活率，引起细胞氧化应激。HSF-1分子及HSPs对热应激反应敏感，可能提高细胞的耐热能力。跨膜氨基酸转运载体及葡萄糖转运载体基因表达也发生了改变，推测热应激条件下乳糖及乳蛋白合成下调与跨膜氨基酸及葡萄糖转运载体基因表达有关。

[1]SANH M V，WIKTORSSON H，LY L V.Effect of feeding level on milk production，body weight change，feed conversion and postpartum oestrus of crossbred lactating cows in tropical conditions[J].LivestProdSci，2002，77(2-3)：331-338.

[2]ST-PIERRE N R，COBANOV B，SCHNITKEY G.Economic losses from heat stress by US livestock industries[J].JDairySci，2003，86：52-77.

[3]SHWARTZ G，RHOADS M L，VANBAALE M J，et al.Effects of a supplemental yeast culture on heat-stressed lactating Holstein cows[J].JDairySci，2009，92(3)：935-942.

[4]NARDONE A，LACETERA N，BERNABUCCI U，et al.Composition of colostrum from dairy heifers exposed to high air temperatures during late pregnancy and the early postpartum period[J].JDairySci，1997，80(5)：838-844.

[5]KADZERE C T，MURPHY M R，SILANIKOVE N，et al.Heat stress in lactating dairy cows：a review[J].LivestProdSci，2002，77(1)：59-91.

[6]BERNABUCCI U，LACETERA N，RONCHI B，et al.Effects of the hot season on milk protein fractions in Holstein cows[J].AnimRes， 2002，51(1)：25-33.

[7]胡菡，王加启，李发弟，等.高温诱导体外培养奶牛乳腺上皮细胞的应激响应[J].农业生物技术学报，2011，19(2)：287-293.

HU H，WANG J Q，LI F D， et al.Responses of cultrued bovine mammary epithelial cells to heat stress[J].JournalofAgriculturalBiotechnology，2011，19(2)：287-293.(in Chinese)

[8]LEE J M，JOHNSON J A.An important role of Nrf2-ARE pathway in the cellular defense mechanism[J].JBiochemMolBiol，2004，37(2)：139-143.

[9]LI Y，CAO Y，WANG F，et al.Scrotal heat induced the Nrf2-driven antioxidant response during oxidative stress and apoptosis in the mouse testis[J].ActaHistochem，2014，116(5)：883-890.

[10]MUECKLER M，THORENS B.The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters[J].MolAspectsMed，2013，34(2-3)：121-138.

[11]HU H，WANG J Q，BU D P，et al.Invitroculture and characterization of a mammary epithelial cell line from Chinese Holstein dairy cow[J].PLoSOne，2009，4(11)：e7636.

[12]OTHMEN Z O，GOLLI E E，ABID-ESSEFI S，et al.Cytotoxicity effects induced by Zearalenone metabolites，α Zearalenol and β Zearalenol，on cultured Vero cells[J].Toxicology，2008，252(1-3)：72-77.

[13]周振峰，崔瑞莲，王加启，等. 热应激对体外培养奶牛乳腺上皮细胞生长、凋亡及其热休克蛋白mRNA转录的影响[J]. 畜牧兽医学报，2010，41(5)：600-607.

ZHOU Z F，CUI R L，WANG J Q， et al. Cell growth，apoptosis and the mRNA transcription of heat shock protein：effects of heat stress on bovine mammary epithelial cells[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2010，41(5)：600-607.(in Chinese)

[14]赵珂.奶牛乳腺上皮细胞葡萄糖摄取的调控及其对乳成分合成的影响研究[D]. 杭州：浙江大学，2011.

ZHAO K.Studies on the regulation of glucose transport and utilization in bovine mammary epithelial cells[D].Hangzhou：Zhejiang University，2011.(in Chinese)

[15]AMIN A，GAD A，SALILEW-WONDIM D，et al.Bovine embryo survival under oxidative-stress conditions is associated with activity of the NRF2-mediated oxidative-stress-response pathway[J].MolReprodDev，2014，81(6)：497-513.

[16]HE M，SIOW R C，SUGDEN D，et al.Induction of HO-1 and redox signaling in endothelial cells by advanced glycation end products：a role for Nrf2 in vascular protection in diabetes[J].NutrMetabCardiovasDis，2011，21(4)：277-285.

[17]SONNA L A，FUJITA J，GAFFIN S L，et al.Invited review：effects of heat and cold stress on mammalian gene expression[J].JApplPhysiol， 2002，92(4)：1725-1742.

[18]LI L，SUN Y，WU J，et al.The global effect of heat on gene expression in cultured bovine mammary epithelial cells[J].CellStressChaperones， 2015，20(2)：381-389.

[19]DU J，DI H S，GUO L，et al.Hyperthermia causes bovine mammary epithelial cell death by a mitochondrial-induced pathway[J].JThermBiol，2008，33(1)：37-47.

[20]PIRKKALA L，NYKNEN P，SISTONEN L.Roles of the heat shock transcription factors in regulation of the heat shock response and beyond[J].FASEBJ，2001，15(7)：1118-1131.

[21]PAGE T J，SIKDER D，YANG L，et al.Genome-wide analysis of human HSF1 signaling reveals a transcriptional program linked to cellular adaptation and survival[J].MolBiosyst，2006，2(12)：627-639.

[22]AKERFELT M，TROUILLET D，MEZGER V，et al.Heat shock factors at a crossroad between stress and development[J].AnnNYAcadSci，2007，1113：15-27.

[23]WINTER A，ALZINGER A，FRIES R.Assessment of the gene content of the chromosomal regions flanking bovine DGAT1[J].Genomics，2004，83(1)：172-180.

[24]LEE W C，WEN H C，CHANG C P，et al.Heat shock protein 72 overexpression protects against hyperthermia，circulatory shock，and cerebral ischemia during heatstroke[J].JApplPhysiol，2006，100(6)：2073-2082.

[25]COLLIER R J，STIENING C M，POLLARD B C，et al.Use of gene expression microarrays for evaluating environmental stress tolerance at the cellular level in cattle[J].JAnimSci，2006，84(Suppl)：1-13.

[26]COLLIER R J，ABDALLAH M B，HERNANDEZ L L，et al.Prostaglandins A1 (PGA1) and E1 (PGE1) alter heat shock protein 70 (HSP-70) gene expression in bovine mammary epithelial cells (BMEC)[J].JAnimSci， 2007，85：62.

[27]DOKLADNY K，WHARTON W，LOBB R，et al.Induction of physiological thermotolerance in MDCK monolayers：contribution of heat shock protein 70[J].CellStressChaperones， 2006，11(3)：268-275.

[28]CHANG S W，LEE S I，BAE W J，et al.Heat stress activates interleukin-8 and the antioxidant system via Nrf2 pathways in human dental pulp cells[J].JEndod，2009，35(9)：1222-1228.

[29]宋小珍，付戴波，瞿明仁，等.热应激对肉牛血清内分泌激素含量、抗氧化酶活性及生理生化指标的影响[J].动物营养学报，2012，24(12)：2485-2490.

SONG X Z，FU D B，QU M R， et al. Effects of heat stress on endocrine hormone content，antioxidant enzyme activity and physiological and serum biochemical indices of beef cattle[J].ChineseJournalofAnimalNutrition，2012， 24(12)：2485-2490.(in Chinese)

[30]KENSLER T W，WAKABAYASHI N，BISWAL S.Cell survival responses to environmental stresses via the Keap1-Nrf2-ARE pathway[J].AnnuRevPharmacolToxicol，2007，47：89-116.

[31]BAUMRUCKER C R.Amino acid transport systems in bovine mammary tissue[J].JDairySci，1985，68(9)： 2436-2451.

[32]SHENNAN D B. Mammary gland membrane transport systems[J].JMammaryGlandBiolNeoplasia，1998，3(3)：247-258.

[33]HUNDAL H S，TAYLOR P M.Amino acid transceptors：gate keepers of nutrient exchange and regulators of nutrient signaling[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab， 2009,296(4)：E603-E613.

[34]PINILLA J，ALEDO J C，CWIKLINSKI E，et al. SNAT2 transceptor signalling via mTOR：a role in cell growth and proliferation[J].FrontBiosci(EliteEd)，2011，3：1289-1299.

[35]NICKLIN P，BERGMAN P，ZHANG B，et al.Bidirectional transport of amino acids regulates mTOR and autophagy[J].Cell，2009，136(3)：521-534.

[36]DRUMMOND M J，GLYNN E L，FRY C S，et al.An increase in essential amino acid availability upregulates amino acid transporter expression in human skeletal muscle[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab，2010，298(5)：E1011-E1018.

[37]ZHAO F Q，KEATING A F.Functional properties and genomics of glucose transporters[J].CurrGenomics，2007，8(2)：113-128.

[38]ZHAO F Q，KEATING A F.Expression and regulation of glucose transporters in the bovine mammary gland[J].JDairySci，2007，90(Suppl 1)：E76-E86.

[39]YU Q，ZHU L，LIN J，et al.Functional analyse of GLUT1 and GLUT12 in glucose uptake in goat mammary gland epithelial cells[J].PLoSOne，2013，5，8(5)：e65013.

[40]BALOGH G，MAULUCCI G，GOMBOS I，et al.Heat stress causes spatially-distinct membrane re-modelling in K562 leukemia cells[J].PLoSOne，2011，6(6)：e21182.

(编辑郭云雁)

Heat Stress-induced Cell Injury and Effects on the Gene Expression of Milk Synthesis-related Transporters in Dairy Cow

QUAN Su-yu1，2，ZHANG Yuan-shu1*，BU Deng-pan2，3，4*

(1.TheAnimalPhysiologyandBiochemistryLaboratoryoftheMinistryofAgriculture，NanjingAgricultureUniversity，Nanjing210095，China；2.StateKeyLaboratoryofAnimalNutrition，InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China；3.CAAS-ICRAFJointLaboratoryonAgroforestryandSustainableAnimalHusbandry，Beijing100193，China；4.SynergeticInnovationCenterofFoodSafetyandNutrition，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

Bovine mammary epithelial cell was chosen as the model to find the factors impairing lactation performance of dairy cow during heat stress.Cell vitality，mitochondrial membrane potential and the expression of genes related to heat shock molecule and proteins，oxidative stress，amino acids and glucose transporters were detected in the bovine mammary epithelial cells treated for 0，0.5，1，1.5，2，4，8 and 12 h at 42 ℃，respectively.The result showed that different heat treatment time significantly reduced mammary epithelial cell vitality (P<0.05) and damaged mitochondrial membrane potential.The expression ofHSP27 decreased significantly (P<0.05)，whileHSP70 increased significantly (P<0.05).The expression ofHSP90 increased significantly in 0-4 h (P<0.05)，and returned to normal level after then.The expression ofHSF-1 increased significantly in some time points (P<0.05).The gene expression of Keach like ECH-associated protein-1 (Keap1) showed no significant difference(P>0.05)，while nuclear factor-E2-related factor 2 (Nrf2) and NAD (P) H dehydrogenase quinone-1 (NQO1) increased significantly (P<0.05).The gene expression of transmembrane amino acid transporterSLC7A7 increased significantly in 1 h and 4 h(P<0.05).The gene expression of glucose transportersGLUT1 andGLUT8 decreased significantly (P<0.05).The expression of glucose transporterGLUT12 increased significantly during 0-2 h，and decreased significantly during 4-12 h (P<0.05).In conclusion，heat stress could significantly reduce the cell vitality，cause oxidative stress，change the gene expression of heat shock proteins and molecule and membrane transport carriers.

heat stress；bovine mammary epithelial cell；cell vitality；mitochondrial membrane potential；oxidative stress；heat shock protein；membrane transport carriers

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.023

2015-09-23

国家自然科学基金(31372341)；“十二五”科技支撑计划(2012BAD12B02-5)；中国农业科学院科技创新工程(ASTIP-IAS07)

权素玉(1989-)，女，河北平山人，硕士生，主要从事反刍动物营养研究， E-mail:1203457176@qq.com

张源淑，教授，E-mail:zhangyuanshu@sina.com；卜登攀，研究员，E-mail:budengpan@126.com

S852.23

A

0366-6964(2016)08-1704-10