MRP8/MRP14对宫颈癌细胞增殖的影响及机制

胡兵荣，王娟，罗海华，姜勇

(南方医科大学基础医学院，广东省蛋白质组学重点实验室，广州510515)



MRP8/MRP14对宫颈癌细胞增殖的影响及机制

胡兵荣，王娟，罗海华，姜勇

(南方医科大学基础医学院，广东省蛋白质组学重点实验室，广州510515)

目的探讨髓样相关蛋白8/14异源二聚体(MRP8/MRP14)对宫颈癌细胞增殖的影响及机制。方法体外培养人宫颈癌Hela细胞，加入MRP8/MRP14(观察组)，另设对照组加入等体积PBS，于培养12、24、48、72 h分别采用CCK8法检测两组细胞增殖能力。取Hela细胞进行核质分离，加入MRP8/MRP14共培养30 min，采用Western blot法检测细胞凋亡相关信号通路蛋白p38 MAPK、JNK及细胞增殖相关信号通路蛋白ERK1/2、NF-κB表达。将Hela细胞分为MRP8/MRP14组和p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制剂组，RP8/MRP14组加入MRP8/MRP14；抑制剂组先分别加入p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制剂预处理2 h，再加入MRP8/MRP14；采用CCK8法观察各组细胞增殖能力。结果观察组加入MRP8/MRP14培养12、24、48、72 h后，细胞增殖能力均高于对照组，且随时间延长，细胞增殖能力逐渐增强(P均<0.05)。观察组加入MRP8/MRP14培养30 min后，与对照组比较，p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性明显升高，NF-κB在细胞核中的表达升高(P均<0.05)。p38 MAPK、JNK抑制剂组细胞增殖能力较MRP8/MRP14组增强；ERK、NF-κB抑制剂组细胞增殖能力较MRP8/MRP14组减弱(P均<0.05)。结论 MRP8/MRP14能够促进Hela细胞增殖，其机制与p38 MAPK、JNK、ERK1/2及NF-κB等多条相关信号通路被激活有关。

宫颈癌；髓样相关蛋白8/14异源二聚体；细胞增殖

髓样相关蛋白8(MRP8)和髓样相关蛋白14(MRP14)均属于钙结合蛋白S100家族成员，是重要的内源性损伤相关模式分子[1]，在体内主要以异源二聚体MRP8/MRP14的形式发挥其生物学活性。MRP8/MRP14的生物学功能极其丰富，参与蛋白质磷酸化、细胞骨架重塑、细胞迁移、调节钙离子稳态、花生四烯酸代谢、对中性粒细胞中的NADPH氧化酶的调控等过程[2]。研究表明，MRP8/MRP14与肿瘤的发生发展、转移有密切关系[3]。p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB在多种肿瘤中广泛表达并参与介导细胞的分化、增殖及凋亡[4～6]。目前,关于MRP8/MRP14在宫颈癌中的作用少见报道。2015年2～12月，我们观察了MRP8/MRP14对宫颈癌Hela细胞增殖的影响，并观察细胞凋亡通路相关蛋白p38 MAPK、JNK及细胞增殖通路相关蛋白ERK1/2、NF-κB的表达情况，探讨MRP8/MRP14在宫颈癌发生发展中的作用及机制。

1　材料与方法

1.1材料子宫颈癌Hela细胞株由本实验室冻存。MRP8与MRP14蛋白分别使用大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞从构建完成的原核表达载体中纯化得到，参照文献[4]方法按等摩尔比混匀，使其形成MRP8/MRP14。核质分离匀浆缓冲液和核质分离核提取缓冲液参照文献[5]方法配置。

1.2细胞培养将Hela细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置5% CO2、37 ℃培养箱中，待细胞生长至85%融合时进行传代。

1.3MRP8/MRP14对细胞增殖能力影响观察取对数生长期细胞，以3×103/孔接种于96孔板，观察组加入1.5 μg/mL的MRP8/MRP14，另设对照组加入等体积PBS。培养12、24、48、72 h后加入10 μL CCK8，继续孵育2 h。使用酶标仪于450 nm处检测各孔吸光度A值，以此表示细胞增殖能力。

1.4MRP8/MRP14对p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性及NF-κB表达影响观察采用Western blot法。取对数生长期细胞，以3×105/皿接种于培养皿，观察组加入1.5 μg/mL的MRP8/MRP14，另设对照组加入等体积PBS。培养30 min后加入相应一抗4 ℃孵育过夜，与1∶5 000稀释的HRP标记的抗鼠IgG室温孵育1 h。经化学发光底物显色，利用Kodak IS4000R图像工作站检测p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性。另取对数生长期细胞进行核质分离，按上述方法检测细胞核中NF-κB表达，以Lamin B1单克隆抗体作为内参，以目的蛋白与内参的灰度比值表示目的蛋白的活性或表达量。

1.5p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制剂对MRP8/MRP14作用影响观察取对数生长期细胞，以3×103/孔接种于96孔板，分为MRP8/MRP14组和p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制剂组，每组设5个复孔。MRP8/MRP14组加入1.5 μg/mL MRP8/MRP14；抑制剂组先分别加入SB203580、SP600125、PD98095、Bay117082预处理2 h，再加入1.5 μg/mL MRP8/MRP14。培养12、24、48、72 h后加入10 μL CCK8孵育2 h，使用酶标仪于450 nm处检测各孔吸光度A值,以此表示细胞增殖能力。

2　结果

2.1MRP8/MRP14对细胞增殖能力的影响培养24 h后，观察组较对照组细胞增殖明显增强(P均<0.05)，随作用时间延长，细胞增殖更加明显(P均<0.01)。

表1　MRP8/MRP14对细胞增殖的影响

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.2MRP8/MRP14对p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性及NF-κB表达的影响加入MRP8/MRP14后，p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性及细胞核内NF-κB 表达均明显增加。见表2。

表2　MRP8/MRP14对p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性及NF-κB表达的影响

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.3p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制剂对MRP8/MRP14的细胞增殖作用的影响与MRP8/MRP14组比较，p38 MAPK、JNK抑制剂组细胞增殖能力随时间延长逐渐增强，ERK1/2、NF-κB抑制剂组细胞增殖能力随时间延长逐渐下降(P<0.05或<0.01)。见表3。

表3　p38 MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB抑制剂对MRP8/MRP14细胞增殖作用的影响

注：与MRP8/MRP14组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3　讨论

MRP8/MRP14属钙结合蛋白S100家族成员，目前其研究主要集中在炎症及自身免疫性疾病发展过程中的作用。S100蛋白家族与肿瘤也有密切关系，广泛参与胃癌、前列腺癌、皮肤癌、食管癌、结直肠癌等多种肿瘤的发展、转移及免疫耐受过程[7]。探讨MRP8/MRP14在宫颈癌发生发展中的作用及机制具有重要意义。

本研究显示，MRP8/MRP14可显著促进宫颈癌细胞增殖。进一步观察显示，MRP8/MRP14可促进肿瘤增殖、凋亡相关信号通路中的重要激酶p38 MAPK、JNK、ERK1/2活性明显升高，细胞核中的NF-κB表达也显著增多，表明它们相对应的信号通路被激活。使用ERK1/2及NF-κB磷酸化激酶抑制剂后，Hela细胞增殖能力明显减弱；使用p38 MAPK、JNK磷酸化激酶抑制剂后，由于促凋亡通路被抑制，MRP8/MRP14的促细胞增殖能力反而稍有增强。

早期研究发现，多种致炎因子可以激活Hela细胞中的p38 MAPK信号通路，促进抑癌基因c-myc翻译增加，从而启动Hela细胞凋亡程序[8]；JNK通路活化使c-Jun磷酸化水平增加并增强Caspase-3活性，在细胞凋亡中发挥重要作用[9]；ERK1/2通过调节可易位基因c-myc的表达，促进肿瘤细胞增殖和转移[10]；肿瘤发生发展过程中NF-κB激酶活性增加与肿瘤生长转移密切相关[11]。因此，细胞增殖多数是由于促进细胞增殖的通路如ERK1/2和NF-κB被活化或促进细胞凋亡的通路如p38 MAPK、JNK被抑制所产生的表观效应。本研究显示，在宫颈癌Hela细胞中，以上多种作用明确的信号通路均在MRP8/MRP14作用后活化。已有报道显示，MRP8/MRP14在前列腺癌增殖凋亡过程中能同时激活p38 MAPK通路和NF-κB通路，从而发挥细胞因子样双向作用[4]。提示MRP8/MRP14对宫颈癌细胞的增殖效应的表现可能不仅仅是由于细胞增殖相关通路的活化或者细胞凋亡通路被抑制，这个过程与p38 MAPK、JNK、ERK1/2及NF-κB等多条增殖凋亡信号通路均密切相关。宫颈癌细胞受到MRP8/MRP14刺激后，细胞内促进增殖的信号通路与促进凋亡的信号通路同时被激活，而最终MRP8/MRP14对宫颈癌细胞作用的总效应表现为促增殖作用。这可能是由于促增殖效应通路活化更强，而促细胞凋亡效应通路的作用相对较弱，于是细胞产生的促增殖效应更明显，从而掩盖了MRP8/MRP14导致细胞产生的促凋亡效应。因此推测，MRP8/MRP14可能是快速进展型宫颈癌的生物学指标之一，如果宫颈癌局部组织中浸润有MRP8/MRP14，很可能会导致肿瘤细胞增殖加快。通过抑制相应促增殖信号通路(如ERK1/2和NF-κB)或活化相应促凋亡信号通路(如p38 MAPK和JNK)可能有助于控制肿瘤的进展。

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Effects of MRP8/MRP14 on proliferation of cervical cancer cells and the mechanism

HUBingrong,WANGJuan,LUOHaihua,JIANGYong

(SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

ObjectiveTo investigate the effect of myeloid-related protein-8/14 heterodimer (MRP8/MRP14) on the proliferation of cervical cancer Hela cells and the possible mechanism. MethodsCervical cancer cell line Hela was cultured in vitro and treated with MRP8/MRP14 (observation group) or PBS(control group), then we measured the proliferation ability at 12, 24, 48 and 72 h with CCK8. The nuclear of Hela cells was separated and then Hela cells were cultured with MRP8/MRP14 for 30 min. The expression of apoptosis-related signaling pathway protein p38 MAPK, JNK and proliferation-related signaling pathway protein ERK1/2 and NF-κB was measured by Western blotting. Hela cells were divided into MRP8/MRP14 group, p38 MAPK, JNK, ERK1/2 and NF-κB inhibitor group. Hela cells in the MRP8/MRP14 group were only treated with MRP8/MRP14, and the inhibitor groups were pretreated with p38 MAPK, JNK, ERK1/2 or NF-κB inhibitor for 2 h then were incubated with MRP8/MRP14. The proliferation ability of Hela cells were detected by CCK8. ResultsCompared with the control group, MRP8/MRP14 enhanced the Hela cell proliferation ability at 12, 24, 48 and 72 h, and the proliferation ability increased gradually as time passed in the observation group (allP<0.05). After the treatment of MRP8/MRP14 for 30 min, p38 MAPK, JNK and ERK1/2 were activated and the expression of NF-κB in the nucleus was increased (allP<0.05). In the p38 MAPK and JNK inhibitor groups, the proliferation ability of Hela cells were increased, while the proliferation ability of Hela cells were decreased in the ERK and NF-κB inhibitor groups as compared with that of the MRP8/MRP14 group (allP<0.05). ConclusionMRP8/MRP14 can promote the proliferation of Hela cells and this mechanism may be related with the activation of p38, JNK, ERK1/2 and NF-κB signaling pathways.

cervical carcinoma; myeloid-related protein-8/14 heterodimer; cell proliferation

国家自然科学基金资助项目(81030055，81372030)。

胡兵荣(1990-)，女，硕士研究生，主要研究方向为炎症与肿瘤细胞信号转导。E-mail： 1053556694@qq.com

简介：姜勇(1964-)，男，教授，博士生导师，主要研究方向为炎症及细胞信号传导。E-mail: jiang48231@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.008

R737.33

A

1002-266X(2016)22-0024-03

2016-01-22)