一株用于微生态饲料发酵剂的乳酸菌筛选及培养条件优化

■杨　柳　张　一　陈宇飞

（吉林工商学院食品工程学院，吉林长春　130507）

一株用于微生态饲料发酵剂的乳酸菌筛选及培养条件优化

■杨柳张一陈宇飞

（吉林工商学院食品工程学院，吉林长春130507）

对用于微生态饲料发酵剂的乳酸菌进行筛选和培养条件优化。测定了3种乳酸菌的产酸速度，进行了大肠杆菌的抑菌效果试验，并利用梅里埃细菌鉴定系统对优良菌种进行鉴定，得出A型乳酸菌的产酸速度快、抑菌效果好，并鉴定该菌为戊糖片球菌；通过研究培养条件诸因素对乳酸菌生物量的影响，研究得出：培养温度30℃、静置培养、接种量1%、氮源选择蛋白胨、碳源浓度为8%～10%、初始pH值为6.5，该条件下乳酸菌的生物量最大。为微生物饲料发酵剂菌种的开发与应用提供理论参考。

微生态；发酵剂；乳酸菌；生物量；筛选；优化

乳酸菌是一种存在于生物体内的益生菌，它能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇等作用。目前，许多学者都对乳酸菌做了深入的研究。

乳酸菌筛选方面，杨亚晋等从自然生物环境中筛选产高效抑菌蛋白的乳酸菌，通过形态学、生理生化、糖发酵（API）和16SrDNA基因序列同源性分析进行菌种鉴定；张慧杰等从苜蓿、玉米、青贮饲料中分离得到5株乳酸菌，通过产酸速率和生长曲线等指标筛选出产酸较快、生长迅速的菌株作为制备乳酸菌青贮饲料添加剂的优良菌株。

乳酸菌优化方面，侯霞霞等对筛选出的优良菌株进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定，并进一步研究其生长温度范围、酸碱耐受性和耐盐性；尹望等

对一株猪源乳酸菌的培养条件进行优化，并研究其对胆盐及酸性环境的耐受性，得出相同胆盐质量分数下，培养时间越长，活菌数越低；洪梅等对采集自德国青贮窖中主导菌群中一株乳酸菌GLP01进行了分子学鉴定， 并对培养条件进行了优化。饲料发酵剂应用方面，杨艳等以紫花苜蓿为材料，以5株乳酸菌为添加剂，测定苜蓿料化学成分的动态变化规律及各因素间的相关性；朱雯等采用正交试验设计，研究乳酸菌、米糠和水分添加量对青贮茭白鞘叶质量的影响。得出乳酸菌的添加显著提高了青贮品质，利于提高青贮发酵的有氧稳定性。本文对实验室3株乳酸菌进行筛选后，根据产酸速度和抑菌效果，确定A型菌为优良菌种。采用细菌鉴定系统，A型菌鉴定为为戊糖片球菌，对其培养条件进行优化，为与其他菌种复配，生产出更加优良的微生态饲料发酵剂提供理论参考。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种

A型乳酸菌、B型乳酸菌、C型：乳酸菌、大肠杆菌。保存于吉林工商学院食品工程学院实验中心。

1.1.2培养基

营养琼脂培养基、MRS培养基、发酵培养基。

1.1.3主要仪器设备

IBE5000I型显微镜，重庆光学仪器有限公司；TGL16A型离心机，上海赵迪生物科技有限公司；PHSJ-4F精密pH计，上海上天精密仪器有限公司；BCD-252KSF冰箱，青岛海尔集团公司；SHA-BA恒温振荡器，上海世平集团有限公司；SPX-250A-Z型培养箱，上海市百典仪器厂；R206D型旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；101-2型干燥箱，上海安竞实验设备有限公司；CP214型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；YXQ.SG46-280S型高压灭菌锅，西化仪（北京）科技有限公司；SW-CJ-2FD型超净工作台，苏州安泰。

1.2方法

1.2.1pH值检测

将3种乳酸菌分别接入培养基中，于35℃恒温培养震荡器中培养，每隔2 h测定1次，每次做3个平行样本试验，共测12次。

1.2.2抑菌率的测定

菌饼的制备：将大肠杆菌活化后接种在营养琼脂培养平板上，37℃恒温培养24 h，制成直径4 mm的菌饼，放在4℃冰箱中，备用。

抑菌率计算：将菌饼放入含浓度200 mg/ml乳酸菌的培养基中，35℃恒温培养，48 h后采用十字交叉法，测定抑菌率。

式中：M——抑菌率（%）；

A——对照菌生长量（mm）；

C——处理菌生长量（mm）。

1.2.3菌种鉴定

利用梅里埃细菌半自动鉴定系统进行检测。具体如下：

乳酸菌在固体平板画线分离，35℃恒温培养48 h，反复画线分离三次，分出单个菌落，接入细菌半自动鉴定系统API试剂条进行检测，35℃恒温培养48 h后系统测定。

1.2.4培养条件的优化

先将温度定位35℃、摇瓶转速100 r/min、接种量1%、氮源为蛋白胨、葡萄糖浓度8%、初始pH值7.0，分别测定温度、摇瓶转速、接种量、氮源种类、碳源浓度、初始pH值对乳酸菌生物量的影响。

2　结果与分析

2.1菌种筛选结果

图1　乳酸菌培养时间与pH值的关系

2.1.1菌种产酸速度由图1可知：随着培养时间延长，pH值都呈下降趋势。A型乳酸菌在0～8 h期间pH值下降较快，8～12 h下降较为平缓，12 h达到最低值，约4.5左右。B型乳酸菌和C型乳酸菌下降较为缓慢，分别在20 h和24 h下降到最低值5.0左右。可见，A型乳酸菌产酸速度较快，适合作微生态饲料发酵剂的发酵菌种。

2.1.2菌种抑菌效果

图2　乳酸菌的抑菌效果

由图2可知：A型乳酸菌抑制大肠杆菌的能力较强，抑菌率达到92%，B型乳酸菌的抑菌能力略低，而C型乳酸菌的抑菌率只有15%，说明A型乳酸菌、B型乳酸菌具有较好的抑菌能力，可用于饲料发酵剂中抑制大肠杆菌的生长。

2.1.3菌种鉴定结果

A型乳酸菌通过梅里埃半自动细菌鉴定系统检测，鉴定为戊糖片球菌，其鉴定%ID值为99.6，T值为0.84。%ID值为鉴定百分率，是每个细菌条目生化反应的出现概率值与该细菌条目所在分类菌群中的所有细菌条目生化反应出现概率值总和的比值。即表示的是每种细菌出现的可能性；T值为某细菌条目的总出现频率除以该细菌条目最典型菌的总出现频率得到的值。T值代表的是个体相较于最普遍情况的近似性。%ID和T值均较接近1，因此，具有极高的可信度。

2.2培养条件优化结果

2.2.1温度对乳酸菌生物量的影响

图3　温度对乳酸菌生物量的影响

由图3可知：随着培养时间的增长，曲线呈上升趋势，生物量逐渐增加；14 h之后，曲线趋于平稳，说明此时已进入生长对数期的末期。培养时间在8 h之内，除了在25℃培养条件下生物量较低以外，35、37℃下的生物量增加速度高于30℃培养条件下的生物量。说明微生物的生长繁殖受温度影响较大，高温促进微生物的生长。培养时间大于10 h之后，30℃培养条件下生物量增长速度加快，最高值为12.8 g/l，说明30℃是该乳酸菌的最适生长温度。

2.2.2摇瓶转速对乳酸菌生物量的影响

图4　摇瓶转速对乳酸菌生物量的影响

由图4可知：两种条件下培养的乳酸菌曲线形态相似，生物量差别不大，即乳酸菌在培养过程中不需要摇瓶震荡培养。摇瓶震荡培养的目的是为了生长分裂的细胞均匀分布，增加溶氧量，以便使细胞生长过程保持充足的氧气。说明了该种乳酸菌为兼性厌氧微生物，培养过程无需增加氧气，可以静止培养。

2.2.3接种量对乳酸菌生物量的影响

图5　接种量对乳酸菌生物量的影响

由图5可知：接种量对乳酸菌生长量的影响是阶段性的差异。即接种量对最高生物量无影响，但达到最高生物量的时间，即生长的对数期末期时间有差异。较高浓度的接种量进入对数期末期的时间更短，考虑生产成本，选择1%的接种量较为理想。

图6　氮源种类对乳酸菌生物量的影响

2.2.4氮源种类对乳酸菌生物量的影响由图6可知：氮源种类对乳酸菌生长量的影响较大，乳酸菌利用硝酸盐、铵盐的能力较差，蛋白胨和酵母膏较大地促进了乳酸菌的生长。酵母膏可能含有

B族维生素，对乳酸菌具有刺激作用，蛋白胨是天然的有机含氮化合物，成分中含有少量的生长因子，对乳酸菌生长有利。因此，乳酸菌利用有机氮的能力较强，从成本考虑选择蛋白胨作为氮源。

2.2.5碳源浓度对乳酸菌生物量的影响

图7　碳源浓度对乳酸菌生物量的影响

由图7可知：葡萄糖浓度对乳酸菌生物量影响不大，呈现先增高、后降低的趋势。碳源是微生物生长的能源物质，碳源不足，微生物生长受阻，碳源过多，微生物内含量过多，同样影响微生物的生长。因此，8%～10%的碳源含量有利于乳酸菌的生长。

2.2.6初始pH值对乳酸菌生物量的影响

图8　初始pH值对乳酸菌生物量的影响

由图8可知：随着pH值的升高，乳酸菌的生物量逐渐增加，当pH值＞7时，略有下降，说明该乳酸菌的最适pH值范围是6.5～7.0，。即该乳酸菌适合中性偏酸的环境，与酵母等真菌生活环境相近，这为多菌混合研究微生态饲料发酵剂提供方便，因此，选pH值6.5为佳。

3　结论

本文研究了A型、B型、C型乳酸菌的菌种筛选及培养条件的优化。进行了3种乳酸菌产酸试验、大肠杆菌抑菌试验、菌种鉴定试验。结果得出：A型乳酸菌产酸速度明显高于B型和C型，从抑菌效果来看，A型和B型乳酸菌抑菌效果较好。综合考虑，选择A型乳酸菌作为微生态饲料发酵剂的菌种，利用梅里埃细菌鉴定系统对优良菌种进行鉴定，鉴定该菌为戊糖片球菌。

在培养条件优化试验中，分别作了温度、摇瓶震荡、接种量、氮源种类、碳源浓度、初始pH值等因素对乳酸菌生物量的影响试验，得出：培养温度为30℃、静止培养、接种量为10%、氮源种类选择蛋白胨、碳源浓度为8%～10%、初始pH值为6.5，该条件下获得的乳酸菌生物量最大。

本文不足之处是只研究了一种乳酸菌的培养条件，菌种单一、功能有限，需进一步研究该种乳酸菌与酵母、芽孢杆菌等复配的最佳培养条件，为研究开发多菌混合微生态饲料发酵剂提供理论参考。

Screening of a micro-ecological fodder starter culture lactic acid bacterial strain and optimization of culture conditions

Yang Liu，Zhang Yi，Chen Yufei

A micro-ecological fodder starter culture lactic acid bacterial strain was screened and the culture conditions were optimized in this article.The acid production rate of three kinds of lactic acid bacteria was determined，and the antibacterial test for e.coli was carried out.Meanwhilethe excellent strains were identified by using French bacteria identification system.The result shows that the acid production rate of type A lactic acid bacteria was fast，with good antibacterial effect.And the type A lactic acid bacteria was identified asPediococcus pentosus.By studying the effect of each culture condition on biomass of lactic acid bacteria，we reached that the culture temperature was 30℃，stilling culture，inoculum size was 1%，choosing peptone as nitrogen source with the concentration of 8%～10%，the initial pH was 6.5.Under this condition，the biomass of lactic acid bacteria was the highest. These provided a theoretical reference for development and application of micro-ecological fodder starter culture strains.

micro-ecology；starter culture；lactic acid bacteria；biomass；screening；optimization

（12篇，刊略，需者可函索）（编辑：王芳，xfang2005@163.com）

10.13302/j.cnki.fi.2016.05.008

S816.32

A

1001-991X（2016）05-0035-04

杨柳，副教授，研究方向为畜产品加工、微生物学。

陈宇飞，教授。

2015-11-09