异形同刺线虫形态学鉴定及基于核糖体ITS序列分子进化分析研究

高俊峰,王丽坤,李洪斌,崔宇超,侯美如

(黑龙江省兽医科学研究所寄生虫研究室,黑龙江齐齐哈尔161006)

异形同刺线虫形态学鉴定及基于核糖体ITS序列分子进化分析研究

高俊峰,王丽坤,李洪斌,崔宇超,侯美如

(黑龙江省兽医科学研究所寄生虫研究室,黑龙江齐齐哈尔161006)

对采自黑龙江省某鹅场莱茵鹅盲肠内的线虫进行形态学鉴定,然后采取PCR方法扩增虫体核糖体ITS序列,进行序列分析并以ITS序列为标记基因构建系统发生树,分析该线虫与其他虫体的进化关系.结果表明,所分离的虫体为异形同刺线虫(Ganguleterakis dispar),该线虫ITS序列全长为957 bp,其中ITS-1,5.8S和ITS-2大小分别为424 bp, 157 bp和376 bp.应用BI,MP,NJ 3种方法构建系统发生树结果相同,在尖尾目线虫的分支中,本研究的5条异形同刺线虫聚集在一起,与同科的鸡异刺线虫亲缘关系较海绵异刺线虫和Heterakis dahomensis接近.该结果为禽类异形同刺线虫病的分子鉴别诊断方法提供了参考.

异形同刺线虫;ITS序列;分子进化分析

异形同刺线虫隶属于有尾感器亚纲(Secern⁃entia),尖尾目(Oxyurida),异刺科(Heterakidae),同刺属(Ganguleterakis),是一种对禽类危害较大的寄生线虫.该虫寄生于鸭、鹅和野生禽类的盲肠内,造成盲肠组织机械性损伤、盲肠肿大、肠壁增厚形成结节,引起盲肠炎和下痢.同时虫体分泌的毒素和代谢产物使宿主中毒,严重者可造成死亡.

核糖体内转录间隔区(ITS,internal transcribed spacer region)序列被证实是良好的遗传标记[1],广泛的应用于寄生虫领域.目前,关于异形同刺线虫的研究和报道还较少,主要集中在流行病学调查方面,虽然黑龙江省曾有过鹅寄生异形同刺线虫的报道,但并未对形态学进行详细的描述,另外,异形同刺线虫分子领域的研究还未见报道.鉴于此,本试验以莱茵鹅体内分离的异形同刺线虫为研究对象,描述其主要形态学特征,并对其ITS序列进行扩增,探讨其分子进化关系,为异形同刺线虫的分子鉴定及鉴别诊断方法的构建提供参考依据.

1　材料与方法

1.1虫体2014年6月,剖检黑龙江省齐齐哈尔市周边某鹅场病死成年莱茵鹅,于盲肠内收集到大量新鲜虫体,经生理盐水冲洗后,保存于70%乙醇中固定备用.

1.2主要试剂La Taq DNA聚合酶,dNTPs,DL-2 000 DNA Marker,pMD18-T载体,限制性内切酶EcoR I,限制性内切酶Hind III,均购自宝生物工程(大连)有限公司;Tissue DNA Kit,购自OMEGA bio-tek公司;AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量制备试剂盒,购自爱思进生物技术(杭州)有限公司.

1.3形态学鉴定将乙醇中固定的虫体取出,置于载玻片上,加1滴甘油酒精使虫体透明后,于显微镜下观察,记录数据.

1.4总DNA的提取选取5条成虫样品,分别置于无菌离心管中,利用DNA提取试剂盒提取虫体总DNA,提取的DNA样品-20℃保存备用.

1.5ITS序列的扩增及序列分析

采取GenBank登录的通用引物NC2/NC5

上游引物NC5:5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′

下游引物NC2:5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′.

PCR反映体系为25 μL;反应条件为:92℃2 min;92℃30 s、50℃30 s、72℃1 min,共35个循环,最后72℃延伸5 min.PCR扩增产物于0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检验,形成单一清晰条带.

按照胶回收试剂盒说明书将ITS序列纯化回收后,连接于pMD18-T载体中,转化到JM109大肠杆菌感受态细胞内,筛选阳性重组菌,提取质粒DNA,经过PCR鉴定和EcoR I,Hind III双酶切鉴定后,阳性质粒送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序.利用生物学软件DNAStar,将扩增的序列与相关线虫ITS序列进行比对分析,确定ITS各段的大小.

1.6系统发生树的构建以无尾感器亚纲的旋毛虫(Trichinella spiralis)为外群,将本研究所获得的异形同刺线虫与尖尾目已知序列的相关线虫的核糖体序列进行比对分析(见表1).将上述线虫核糖体ITS序列人工进行整合,将ITS-1和ITS-2基因序列串联进行比对,提交引导树.使用MrBayes进行贝叶斯推演构建进化树.最大简约法和最大似然法利用PAUP*4.0b 10软件包,在默认设置下进行分析.绘制系统发生树,探讨异形同刺线虫的系统发生位置.

表1　本研究构建尖尾目线虫系统发生树选择的线虫及相关信息

2　结果

2.1虫体的形态学鉴定此次从鹅体内分离的虫体呈乳白色,体表有横纹,体前部有侧翼膜,头端钝,具有3个唇片.口腔短,食道呈圆柱形,后端为发达的食道球和食道瓣,排泄孔位于食道中部.雄虫长13.2～14.7 mm,尾末端尖细,具有2根等长、形态相同的交合刺,无引带.尾部有发达的尾翼膜,使虫体末端向腹面弯曲,有13对肛乳突及1个圆形的泄殖孔前吸盘;雌虫长15.2～ 18.3 mm,尾细长,末端弯向背面,生殖孔位于体中部稍后方,见中插彩版图1.以上观察结果与参考文献[2]描述的一致,故鉴定为异形同刺线虫. 2.2 ITS序列的扩增与序列分析经通用引物扩增出的异形同刺线虫ITS序列,产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检验,扩增的条带均出现在约1 000 bp位置,与预期目的片段一致(图2),且无非特异性条带.基因片段经测序后人工校正,得到完整的ITS序列,全长为957 bp,其中ITS-1, 5.8S和ITS-2大小分别为424 bp,157 bp和376 bp.将获得的ITS基因序列录入GenBank,获得基因登录号为KM212953.

图2　异形同刺线虫核糖体ITS PCR扩增结果M:DL-2 000标准分子量;1～5:异形同刺线虫样品;6:阴性对照

2.3分子进化分析构建尖尾目线虫系统发生树,以旋毛虫作为外群,参与构群的线虫除了本研究的异刺科的异形同刺线虫外,还包括尖尾科的无刺属、住肠属、钉尾属、管状属,异刺科的异刺属和副盾皮属.结果显示,采用Bayes,MP和NJ 3种方法构建进化树结果基本一致.在尖尾目进化树中,本研究分离的五个异形同刺线虫样品处于聚集在一起,与鸡异刺线虫亲源性最近,处于同一分支,海绵异刺线虫和H.dahomensis亲缘性最近,处于同一分支.有钩副盾皮线虫与其他异刺科线虫具有较高的亲源性,较尖尾科线虫亲源关系近(图3).

图3　MP,BI和NJ 3种方法构建的异形同刺线虫系统发生树

3　讨论

异形同刺线虫病呈世界性分布,多地曾报道[3-5],在黑龙江省,除1981年区域调查时在鸭鹅和王春仁(2004)报道过鸿雁感染过外[6],再未见禽类发生该病的报道,作者分析不是该虫感染少,而是一直被误认为是鸡异刺线虫.尽管鸡异刺线虫和异形同刺线虫成虫形态学非常相似,但是可以通过雄虫交合刺的形状来鉴别.异刺线虫雄虫右侧交合刺较左侧长,而异形同刺线虫具有两根等长的交合刺.本试验分离的线虫根据寄生部位、虫体大小及形态特点与之前文献描述[2]的异形同刺线虫一致,故鉴定为异形同刺线虫.

核糖体DNA(rDNA)序列因其功能上的高度保守性和进化的时钟性,已被广泛地应用于物种分类和遗传进化关系的研究,尤其是物种的种间分类研究[7].唐颖[8]等对东北地区不同地理位置采集的华支睾吸虫ITS1序列多态性研究,结果证实ITS1序列可以区分种间遗传关系.严若峰等[9]对捻转血矛线虫不同药物耐药性虫株,不同地理位置和不同宿主来源的虫株ITS序列进行了研究,结果表明,捻转血矛线虫ITS序列在种内相对保守,不同虫株间变异较小.闫文朝等[10]对兔斯氏艾美耳球虫ITS序列进行研究,发现斯氏艾美耳球虫虫株种内变异率较高,且与鸡球虫和啮齿类动物球虫同源性较低.大量研究表明,ITS序列是寄生虫虫种鉴定和分子诊断方法中具有重要应用价值的基因区段.因此,本试验是首次对异形同刺线虫核糖体ITS序列进行研究报道,通过对ITS序列的比对分析,探讨异形同刺线虫的种间差异情况和在尖尾目中的系统发生关系.

尖尾目线虫中,P.ambiguus的ITS1(292)和ITS2(306)长度均为目前已知最小,而A.tetraptera的ITS1(662)和ITS2(598)长度均为目前已知最大(见表1).本研究扩增的5条异形同刺线虫样品ITS序列,经过生物学软件分析,ITS序列长度为957 bp,其中ITS-1和ITS-2大小分别为424 bp和376 bp,均在尖尾目线虫长度范围内,与先前的研究相一致.本试验5个样品的ITS序列几乎完全一致,仅在样品1中ITS-2的第202位点A突变成C;在样品2中ITS-2的第297位点T突变成C,其余序列均一致.

通过对本试验扩增的异形同刺线虫ITS序列进行分析,与尖尾目线虫同源性分析,与异刺科线虫同源性要远远高于尖尾科线虫,在异刺科内的种间差异为24.2%～52.7%.ITS1和ITS2序列G+C含量分别为44.0%和42.8%,除较P.uninata(49.0%和44.6%)、P.ambiguus(52.4%和57.5%)和S.muris (47.0%和46.8%)的ITS1和ITS2序列G+C含量低,比其他尖尾目线虫ITS1和ITS2序列G+C含量高.

利用Bayes,MP和NJ构建的尖尾目线虫系统发生树结果表明,本试验中的异形同刺线虫样品与鸡异刺线虫亲缘性最近,处于同一分支,海绵异刺线虫和H.dahomensis亲缘性最近,处于同一分支.有钩副盾皮线虫与其他异刺科线虫具有较高的亲源性,较尖尾科线虫亲源关系近,该结果与传统的形态学分类结果相一致,本试验结果表明,ITS片段可作为遗传标记用以鉴定异刺科线虫种间遗传关系,是良好的遗传标记,本试验的结果对异形同刺线虫进一步的分类、鉴定、遗传变异研究、防治等具有重要意义.

[1]牛庆丽,罗建勋,殷宏.转录间隔区(ITS)在寄生虫分子生物学分类中的应用及其进展[J].中国兽医寄生虫病,2008,16 (4):41-47.

[2]赵辉元.家畜寄生虫与防制学[M].长春:吉林科学技术出版社,1996.

[3]Zhao C,Onuma M,Asakawa M,et al.Preliminary studies on de⁃ veloping a nested PCR assay for molecular diagnosis and identifi⁃cation of nematode(Heterakis isolonche)and trematode(Glaphy⁃rostomum sp)in Okinawa rail(Gallirallus okinawae)[J].Vet Para⁃sitol,2009,163(1-2):156-160.

[4]Callinan R B.Nodular typhlitis in pheasants caused by Heterakis isolonche[J].Aust Vet J,1987,64(2):58-59.

[5]Frank C.First detection of Heterakis isolonche in Burgenland[J]. Angew Parasitol,1977,18(3):162-163.

[6]王春仁,邹希明,翟宝库,等.黑龙江省鸿雁体内检出异形同刺线虫[J].黑龙江畜牧兽医,2004(01):38-39.

[7]林睿,黎学铭.吸虫种株基因差异的研究进展[J].广西预防医学,2002,8(5):310-313.

[8]唐颖,路义鑫,韩彩霞,等.东北地区华支睾吸虫ITS1基因序列分析[J].中国预防兽医学报,2011,33(5):405-407.

[9]严若峰,宋小凯,徐立新,等.基于ITS序列的捻转血矛线虫系统进化分析[J].畜牧兽医学报,2012,43(7):1117-1122.

[10]闫文朝,韩利方,张龙现,等.斯氏艾美耳球虫ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列的克隆及PCR检测方法的建立[J].畜牧兽医学报,2012,43(6):1003-1008.

M orphological identification and molecular phylogenetic analyses based on ITS sequences of Ganguleterakis dispar

GAO Jun-feng,WANG Li-kun,LI Hong-bin,CUI Yu-chao,HOU Mei-ru
(Department of Parasitology,Heilongjiang Institute of Veterinary Science,Qiqihar 161006,China)

Morphological identification methods were used to identify the species of the nematode,which were isolated from goose(Rhine geese)intestinal collected from Heilongjiang.Then the ITS sequence was amplified by polymerase chain reaction (PCR)and compared with other nematodes available in GenBankTMby biology software,and phylogenetic relationships betweep them were reconstructed.The result showed that the length of ITS sequence was 957 bp and ITS-1,5.8S and ITS-2 sequences of G.dispar were 424 bp,157 bp and 376 bp in length,respectively.Topologies of all trees inferred by three different methods(BI, MP,and NJ)with different building strategies and/or different distance models were identical.Five samples of G.dispar in the study were clustered together.The result provides a reference for molecular identification diagnostic method of this disease.

Ganguleterakis dispar;ITS sequences;Phylogenetic analyses

HOU Mei-ru

S852.73+1

A

0529-6005(2016)02-0018-03

2014-11-18

黑龙江省青年科学基金项目(QC2014C033)

高俊峰(1985-),男,硕士,主要从事分子寄生虫学与动物寄生虫病防治的研究,E-mail:13766785033@163.com

侯美如,E-mail:houmeiru168@126.com