c-J un在肉鸡腹水综合征过程中肺动脉壁的表达变化及维拉帕米的干预研究

王建琳,乔健

(1.青岛农业大学动物科技学院,山东青岛266109;2.中国农业大学动物医学院,北京海淀100193)

c-J un在肉鸡腹水综合征过程中肺动脉壁的表达变化及维拉帕米的干预研究

王建琳1,乔健2

(1.青岛农业大学动物科技学院,山东青岛266109;2.中国农业大学动物医学院,北京海淀100193)

本试验研究低温诱发肉鸡腹水综合征过程中肺动脉壁c-Jun的表达,及阻断钙信号对肺动脉壁c-Jun表达的影响和对肉鸡腹水综合征发生的干预情况,为肉鸡腹水综合征发生机制的研究提供基础.240只15日龄AA肉鸡分为对照组、低温组和维拉帕米组,15～50日龄每组随机取6只测定右心肥大指数,取肺组织做石蜡组织切片进行c-Jun免疫组化染色分析.结果显示,29～50日龄低温组肉鸡右心肥大指数较对照组和维拉帕米组明显升高(P<0.05),低温组肉鸡20～50 μm、50～100 μm和100～200 μm肺小动脉c-Jun阳性指数分别从22、29日龄和29日龄开始到50日龄极显著高于对照组和维拉帕米组(P<0.01).研究结果认为,低温诱发肉鸡腹水综合征过程中不同直径大小肺小动脉壁c-Jun表达明显增强,阻断钙信号可明显抑制肺小动脉壁c-Jun的表达和肉鸡腹水综合征的发生.

肉鸡;腹水综合征;肺小动脉;c-Jun;钙信号

肉鸡腹水综合征(Ascites Syndrome,AS)是世界公认的肉鸡三大疾病之一,给肉鸡养殖业造成了巨大的经济损失.Julian(1993)提出了肉鸡AS的发生假说,即诱发因素-肺动脉高压-右心肥大、衰竭-后腔静脉回流受阻-肝脏淤血性营养不良-腹水发生[1].其中右心肥大是机体对肺动脉高压的结构性代偿,用右心肥大指数(右心室/全心室的重量,RV:TV)作为评价指标,来反映肺动脉高压的形成、右心衰竭和肉鸡AS的形成[2].

肉鸡肺血管重塑是肺动脉高压的形态学基础,是肉鸡AS的促发因素,以中膜增厚为其主要特征[3].肺动脉平滑肌细胞增殖是中膜增厚的直接原因,与原癌基因c-myc等的表达及钙信号等密切相关[4-6],而有关肉鸡AS发生过程中肺小动脉c-Jun蛋白的表达情况及钙信号对其表达的影响等还未见报道.故本研究拟用免疫组织化学染色技术研究肉鸡AS发生过程中肺动脉c-Jun蛋白表达的动态变化,及用钙通道拮抗剂-维拉帕米阻断钙信号后肺动脉c-Jun蛋白的表达情况和右心肥大指数的变化情况,为肉鸡AS发生机制的研究提供基础.

1　材料与方法

240只14日龄AA肉仔鸡随机分为3组,为对照组(21±2)℃、低温组(11±2)℃和维拉帕米组(11±2)℃(0.01%维拉帕米饮水),每组80只,每组每周随机取6只翅静脉注射戊巴比妥钠处死测定右心肥大指数[7].

取右侧肺组织下1/3固定、制备石蜡组织切片,应用多克隆抗体即用型免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)进行c-Jun免疫组织化学染色,并用苏木素进行复染,显微镜下观察结果.着色为棕色或黄色的为阳性细胞,其余为阴性细胞.结合图像处理系统进行分析计算直径为20～50 μm、50～100 μm和100～200 μm肺小动脉阳性细胞数所占总细胞数的百分比,作为c-Jun阳性指数(PI)[8].

用SPSS11.5软件分析数据,数据表示为:平均数±标准差(Mean±SD),用Independenr-samples T Test方法分析组间差异性,P<0.05为差异显著,P< 0.01为差异极显著.

表1　各组肉鸡右心肥大指数(RV:TV)的动态变化(n=6)

2　结果

2.1各组肉鸡右心肥大指数(RV:TV)的动态变化低温组肉鸡RV:TV从29日龄开始到43日龄极显著高于对照组(P<0.01),50日龄时显著高于对照组(P<0.05),见表1.

2.2各组肉鸡20～50 μm肺小动脉血管平滑肌细胞PI(c-Jun)的变化环境低温诱发肉鸡肺血管重塑过程中,肺动脉血管平滑肌细胞c-Jun蛋白表达明显增加.如表2所示,低温组肉鸡20-50 μm肺小动脉血管平滑肌细胞PI(c-Jun)从22日龄开始到50日龄极显著高于对照组(P<0.01).

表2　各组肉鸡20～50 μm肺小动脉血管平滑肌细胞PI(c-J un)的变化(n=6)

2.3各组肉鸡50～100 μm肺小动脉血管平滑肌细胞PI(c-Jun)的变化低温组肉鸡50～100 μm肺小动脉血管平滑肌细胞PI(c-Jun)从29日龄开始到50日龄极显著高于对照组(P<0.01),见表3.

2.4各组肉鸡100～200 μm肺小动脉血管平滑肌细胞PI(c-Ju)的变化低温组肉鸡100～200 μm肺小动脉血管平滑肌细胞PI(c-Jun)从29日龄开始到50日龄极显著高于对照组(P<0.01),见表4.

表3　各组肉鸡50～100 μm肺小动脉血管平滑肌细胞PI(c-J un)的变化(n=6)

表4　各组肉鸡100～200 μm肺小动脉血管平滑肌细胞PI(c-J un)变化(n=6)

3　讨论

肺动脉平滑肌细胞增殖导致肺动脉中膜增厚,其增殖过程受到部分原癌基因的调控,研究报道c-fos和c-jun等原癌基因参与了人类和哺乳动物血管平滑肌细胞的增殖[9-10].增殖的血管平滑肌细胞胞浆内钙离子浓度明显升高,表明胞浆内钙离子内流的增加是血管平滑肌细胞增殖所必须的[11].而胞浆内钙离子浓度的升高也涉及到了原癌基因c-fos的激活与表达[12].本研究整个过程中,正常组肉鸡不同直径的肺小动脉c-Jun蛋白表达比较平稳,低温组肉鸡20～50 μm,50～100 μm,100～ 200 μm肺小动脉c-Jun蛋白分别于低温处理一周(22日龄)开始增加,并且大部分一直处于持续增加状态.与对照组相比,低温组肉鸡肺动脉c-Jun蛋白的表达于22日龄或29日龄极显著升高,表明环境低温明显诱发了肉鸡肺小动脉c-Jun蛋白的表达.维拉帕米组肉鸡肺小动脉c-Jun蛋白的表达从22日龄或29日龄较低温组极显著降低,表明维拉帕米可明显抑制低温诱发的肉鸡肺小动脉c-Jun蛋白的表达.结合前期维拉帕米可明显抑制低温诱发的肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖的研究结果[6],认为钙信号参与了低温诱发的肉鸡肺小动脉c-Jun蛋白的表达,参与了肺血管重塑.

肺血管重塑导致肺动脉管腔明显缩小,从而增加肺血管阻力,促进了肺动脉压升高.肺动脉压升高将会使右心室压力后负荷增加,故右心肥大是心脏对压力负荷增加的形态学代偿,故右心肥大指数可以直接反映右心肥大程度,也可以间接反映肺动脉压的高低[13].本研究结果发现,肉鸡低温处理两周后(29日龄)开始到试验结束(50日龄)右心肥大指数显著或极显著高于对照组,而维拉帕米组肉鸡右心肥大指数在29日龄到50日龄时显著或极显著低于低温组,表明环境低温诱发了肉鸡右心肥大和肺动脉压升高,维拉帕米明显抑制了低温诱发的肉鸡右心肥大和肺动脉压升高.研究结果表明,钙信号参与了肉鸡右心肥大的发生和肺动脉压升高的过程.

综合以上研究结果认为,低温诱发肉鸡AS过程中肺小动脉c-Jun蛋白表达明显增强,阻断钙信号可抑制低温诱发的肉鸡肺小动脉c-Jun蛋白的过度表达和右心肥大的发生.

[1]Julian R J.Ascites in poultry[J].Avian Pathology,1993,23:419-454.

[2]Julian R J,McMillan I,Quinton M.The effect of cold and dietary energy on right ventricular ypertrophy,right ventricular failure and ascites in meat-type chickens[J].Avian Pathology,1989b, 18:675-684.

[3]王建琳,乔健,赵立红,等.低温诱发肉鸡腹水综合征发生过程中肺血管重塑与肺动脉高压的关系[J].中国兽医学报, 2007,27(6):874-878.

[4]王建琳,乔健,赵立红,等.低温诱发肉鸡腹水综合征过程中肺动脉平滑肌细胞增殖的变化[J].畜牧兽医学报,2007,38 (3):276-281.

[5]王建琳,尹燕博.低温诱发肉鸡肺血管重塑过程中肺动脉平滑肌细胞c-Myc蛋白表达的变化[J].畜牧兽医学报,2011,42 (1):99-103.

[6]王建琳,乔健,赵立红,等.维拉帕米对环境低温诱发肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖的作用[J].中国兽医杂志,2007,43 (12):29-30.

[7]Julian R T.The effect of increased sodium in the drinking water on right ventricle hypertrophy,right ventricular failure and ascites in broiler chickens[J].Avian Pathology,1987,16:61-71.

[8]Marks D S,Vita J A,Folts J D,et al.Inhibit ion of neointimal proliferation in rabbits after vascular injury by a single treatment with a protein adduct of nitric oxide[J].J Clin Invest,1995,96 (6):2630-2638.

[9]Biasin V,Chwalek K,W ilhelm J,et al.Endothelin-1 driven pro⁃liferation of pulomonary arterial smooth muscle cells is c-fos de⁃pendent[J].Int J Biochem Cell Biol,2014,54:137-148.

[10]Ma J,Zhang L,Han W,et al.Activation of JNK/c-Jun is re⁃quired for the proliferation,survival,and angiogenesis induced by EET in pulmonary artery endothelial cells[J].J Lipid Res,2012, 53(6):1093-1105.

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[12]Hardingham G E,Chaw la S,Johnson C M,et al.Distinct func⁃tions of nuclear and cytoplasmic calcium in the control of gene ex⁃pression[J].Nature,1997,385:260-265.

[13]董世山.肺动脉高压在肉鸡腹水综合征发生发展过程中的作用[D].北京:中国农业大学,1999.

Expression of c-J un in the Small Pulmonary Arterials of Broilers in the Development of Ascites Syndrome Induced by Low Ambient Tem perature and the Arrest Effect of Verapam il

WANG Jian-lin1,QIAO Jian2
(1.College of Animal science and Veterinary Medicine,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China; 2.College of Veterinary Medicine,China Agricultural University,Beijing 100193,China)

Expression of c-Jun in pulmonary arterials of broilers in the development of ascites syndrome induced by low ambi⁃ent temperature and the effect of verapamil on the expression of c-Jun and occurrence of ascites syndrome were studied.15-day old broilers were divided into control group,low temperature group and verapamil group.The hearts and lungs in 6 broilers from ev⁃ery group were taken to study the index of right ventricular hypertrophy and the expression of c-Jun in pulmonary arterials respec⁃tively every week from 15 to 50 days old.The result showed that the index of right ventricular hypertrophy in low temperature groups was significantly higher than those in control group and verapamil group.The expression of c-Jun pulmonary arterials with 20～50 μm,50～100 μm and 100～200 μm diameters in broilers in low temperature group were significantly increased from 22 or 29 days to 50 days old compared with those in control group and verapamil group.The result suggested that the expression of c-Jun in pulmonary arterials with different diameters in broilers in the development of ascites syndrome were significantly increased, and blocking the calcium signal pathway could inhibit the high expression of c-Jun in pulmonary arterials and control the occur⁃rence of ascites syndrome in broilers.

broilers;ascites syndrom;pulmonary arterials;c-Jun;calcium signal

QIAO Jian

S858.31

A

0529-6005(2016)02-0009-03

2014-11-15

国家自然科学基金资助项目(30371063);山东省自然科学基金(ZR2013CL022)

王建琳(1976-),女,副教授,博士,主要从事禽病发生机制的研究,E-mail:bjsxxw@126.com

乔健,E-mail:qiaojian@cau.edu.cn