猪繁殖与呼吸综合征病毒新结构蛋白基因ORF5a分子特征

黄娟,任颖超,张玉凤,单虎

(青岛农业大学山东省高校预防兽医学重点实验室,山东青岛266109)

猪繁殖与呼吸综合征病毒新结构蛋白基因ORF5a分子特征

黄娟,任颖超,张玉凤,单虎

(青岛农业大学山东省高校预防兽医学重点实验室,山东青岛266109)

本研究采用RT-PCR方法从临床病料中扩增得到了5株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)山东流行株新结构蛋白ORF5a基因序列,并与国内外其他22株PRRSV ORF5a基因序列进行了比较和分析.结果表明,5株PRRSV山东株ORF5a基因CDS为141 bp,编码46个氨基酸,序列同源性为93.6%～100%(nt)和89.4%～100%(aa);5株山东株与其他Ⅱ型PRRSV同源性为83.0%～99.3%(nt)和72.3%～100%(aa).在ORF5a蛋白上高度保守的R/Q基序区,LX13 (3)株有3个氨基酸的变异,CY13株有1个氨基酸的变异.与2006年以前的毒株相比,我国2006年以后分离的毒株第8、12、28位和42位的氨基酸发生了变异.进化树分析表明,5株PRRSV山东株与高致病性PRRSV代表株JXA1株在同一个亚群.

猪繁殖与呼吸综合征病毒;结构蛋白;ORF5a基因;序列分析

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)于1987年首次发现,我国1996年首次分离到其病原PRRSV, 2006年出现高致病性PRRSV变异株[1].目前该病尚无有效治疗药物,免疫接种也不能完全保护[2].目前,PRRSV的毒力、致病机理及保护性免疫的机制都还缺乏详细的阐述,制约了新型疫苗的研制及PRRS的有效防控.

PRRSV为动脉炎病毒属成员,根据基因和抗原差异性可分为欧洲型(Ⅰ型,代表株LV)和美洲型(Ⅱ型,代表株VR-2332).2011年在动脉炎病毒中发现存在嵌合基因ORF5a,该基因起始于ORF5上游第10 nt处,编码43 aa～64 aa,其中,PRRSV ORF5a蛋白氨基酸序列欧洲型(Ⅰ型)为43 aa,美洲型(Ⅱ型)为46 aa或51 aa[3].ORF5a基因和GP5蛋白基因部分重叠,可能由同一个亚基因组mRNA转录[3]. ORF5a蛋白预测为Ⅰ型膜蛋白,带有一个短外膜区,单一转膜区和一个含8 aa的高度保守的R/Q基序的内膜尾巴[3],反常的是,这个保守的R/Q基序编码区核苷酸序列与GP5外膜区高度变异的糖基化位点序列相同,该糖基化位点与中和抗体及病毒免疫逃避有关[4],因此,这一区域极有可能与PRRSV免疫有关;用PRRSV VR-2332感染猪,可于第4周检测到血清中的ORF5a蛋白特异性抗体,第6周该抗体达到峰值,说明ORF5a蛋白参与PRRSV的体液免疫反应[5].ORF5a蛋白与病毒生存活力也有关系,突变ORF5a基因序列会使PRRSV感染性克隆失去活性[6].

目前,关于PRRSV ORF5a基因文献报道较少,为了了解该基因分子特征,我们从临床疑似PRRS病料中扩增得到了ORF5a编码区,并进行了基因克隆、序列测定和分析,以期为了解PRRSV ORF5a基因变异特点、防控该病提供有价值的信息.

1　材料与方法

1.1病料采集2013年送检疑似PRRS病猪的肺脏、淋巴结,置-70℃保存备用.

1.2主要试剂宿主菌E.coli DH5α、克隆载体pMDT19、oligodT、Ex Taq DNA聚合酶、DNA Marker和DNA胶回收试剂盒,均购自TaKaRa公司;MMLV为Promega公司产品;无内毒素质粒提取试剂盒Ⅱ型,购自美国Omega公司;TRIZol试剂为Invitrogen公司产品.

1.3引物上游引物:5′-CCATTCTGTTGGCAATT TGA-3′,下游引物:5′-GGCATATATCATCACTG⁃GCG-3′,预计PCR产物大小为716 bp,扩增片段包括ORF5和ORF5a.引物送由TaKaRa公司合成.

1.4病料处理与总RNA提取取50～100 mg组织病料,加入1 mL TRIZol试剂,捣碎匀浆后按TRIZol试剂说明书提取总RNA.

1.5RT-PCR用M-MLV和Oligo d(T)反转录获得CDNA.取2 μL cDNA进行PCR反应:94℃3 min; 94℃45 s;58℃45 s;72℃60 s,共30个循环;最后72℃延伸10 min.

1.6PCR产物克隆与测序回收1.0%琼脂糖凝胶中的目的片段,并与pMDT19连接,连接产物转化DH5α感受态细胞后,用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒后PCR鉴定阳性克隆.

1.7ORF5a基因序列分析将阳性质粒送往北京赛百盛基因技术有限公司测序,用DNAStar MegAlign软件对山东流行株和22株参比毒株ORF5a核苷酸和氨基酸序列进行分析,绘制系统进化树.

2　结果

2.1RT-PCR扩增与克隆从5份送检病料中均扩增得到与预期大小相符的核酸片段(图1),分别命名为HD13,LX13(1),LX13(2),LX13(3)和CY13.

图1　PRRSV山东株ORF5a基因RT-PCR扩增

2.2ORF5a基因核苷酸序列同源性分析5株PRRSV山东株ORF5a基因CDS均为141 bp,核苷酸序列同源性为93.6%～100%.与LV(M96262)的相似性为59.8%～60.6%,与VR-2332(AY150564)及其他参考毒株的核苷酸序列相似性在83.0%～ 99.3%之间.

2.3ORF5a氨基酸序列分析

2.3.1ORF5a氨基酸序列同源性比较5株PRRSV山东株的ORF5a基因均编码46个氨基酸,推导的氨基酸同源性为89.4%～100%.与LV的相似性为47.7%～52.3%,与VR-2332及其他参考毒株的氨基酸序列相似性在72.3%～100%.

2.3.2ORF5a氨基酸变异分析ORF5a蛋白第32～39位R/Q基序上,分离株CY13在34位发生了氨基酸的突变(R→Q),LX13(3)在35～37位都发生了突变(Q→R,Q→P,Q→P).另外,我国2006年以后分离的毒株第8、12、28位和42位的氨基酸都发生了变化(见中插彩版图2).

2.4ORF5a进化树分析根据ORF5a基因进化树,Ⅱ型毒株可划分为3个亚群,5株山东株同JXA1和HuN4等高致病性变异株在同一亚群,VR-2332和BJ-4等经典毒株在同一亚群,CH-1a和CH-1R等可归为过渡亚群(图3).本研究的5株PRRSVORF5a的氨基酸序列的进化关系同核苷酸序列的进化关系具有相似性(图4),说明CY13和LX13(3)在R/Q基序上的氨基酸突变没有改变其亚群分布.

图3　ORF5a基因核苷酸序列遗传演化分析

图4　ORF5a基因氨基酸序列遗传演化分析

3　讨论

目前关于PRRSV ORF5a的文献报道较少,我们之前在对PRRSV的RNA干扰研究中发现,靶向ORF5a基因和ORF5基因重叠区的shRNA比单纯靶向ORF5基因的shRNA更能有效抑制PRRSV复制[7],说明ORF5a在PRRSV复制中具有重要作用,但具体机制尚不清楚.Han等[8]将JXA-1传至第80代,在ORF5a内部ORF5之前有4个氨基酸的插入,表明5a蛋白胞外区的长度改变不影响5a蛋白的功能.本文克隆了5株PRRSV山东株ORF5a基因,结果表明其CDS均为141 bp,编码46个氨基酸,属于Ⅱ型PRRSV高致病性毒株.氨基酸比较表明我国2006年以后分离的毒株第8、12、28位和42位的氨基酸与2006年以前的毒株相比都发生了变化,提示这些位点的氨基酸可能与PRRSV的致病性有关.

以CH-1a株为代表的PRRSV亚群Ⅱ和以JXA1株为代表的PRRSV亚群ⅢORF5a都包含46个氨基酸,相比之下,以VR-2332株和BJ-4为代表的PRRSV亚群Ⅰ的的ORF5a蛋白包含51个氨基酸,由此可以推测,ORF5a蛋白C端的5个氨基酸的差异(QLDAM)并未对PRRSV产生生物学或系统发育上的影响,但其他潜在的作用还未得知.ORF5a蛋白C端有一个高度保守的富含谷氨酰胺和精氨酸的R/Q基序,认为能与RNA结合高效调节mRNA的剪接、转运与包装[9].本研究中分离株CY13在R/Q基序34位发生了氨基酸的突变(R→Q),LX13(3)在35～37位都发生了突变(Q→R,Q→P,Q→P),由此猜测,该保守的R/Q基序元发生的突变也许与不同毒株致病力的高低存在一定关系.Ⅰ型PRRSV和其他动脉炎病毒R/Q基序保守性不是那么显著[3],R/Q基序的高度保守性,以及与GP5高度易变的糖基化位点重叠,导致了Ⅱ型PRRSV的毒力较强[10].对ORF5a基因序列进行分析,有助于进一步研究该区域变异性对病毒复制及致病性的影响.

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Sequence Analysis of ORF5a,a New Structural Protein Gene of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

HUANG Juan,REN Ying-chao,ZHANG Yu-feng,SHAN Hu
(Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Universities of Shandong,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

ORF5a gene sequences of five PRRSV strains were obtained from Shandong Provinces by RT-PCR and sequenc⁃ing.ORF5a gene variation of the 5 isolates and other 22 published PRRSV isolates was analyzed.The results showed that the 141 bp ORF5a gene of 5 isolates shared 93.6%～100%nucleotid(nt)and 89.4%～100%amino acid(aa)identity with each other, while have 83.0%～99.3%(nt)and 72.3%～100%(aa)homology with those published strains(typeⅡPRRSV).mutations muta⁃tions occurred in strain LX13(3)at R/Q motif,for strain CY13,and 1 mutation was found in the strain CY13.Compared with strains isolated before 2006,amino-acid mutations at position 8,12,28 and 42 were observed.Phylogenetic analysis suggested that the 5 isolates belonged to the same subgroup with JXA1,the representative strain of highly pathogenic PRRSV.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus;structural protein;ORF5a gene;sequence analysis

SHAN Hu

S852.65+1

A

0529-6005(2016)02-0012-03

2014-11-21

国家科技基础性工作专项(2012FY111000);山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队建设;青岛农业大学高层次人才科研基金(6630719);青岛农业大学应用型人才培养特色名校工程大学生科研创新立项

黄娟(1977-),女,副教授,博士,研究方向为动物传染病防制,E-mail:happyhj888@163.com

任颖超(1989-),女,硕士,研究方向为动物传染病防制, E-mail:sdzbryc@163.com

注:任颖超与黄娟对本文具有同等贡献

单虎,E-mail:shanhu67@163.com