信阳市鲢、鳙鱼爆发性出血病口服疫苗的制备及免疫防治效果研究

2016-09-03 10:44林伟信阳农林学院水产学院464000
当代水产 2016年10期
关键词:鳙鱼粘液水气

■ 林伟 (信阳农林学院 水产学院 464000)

信阳市鲢、鳙鱼爆发性出血病口服疫苗的制备及免疫防治效果研究

■ 林伟 (信阳农林学院 水产学院 464000)

鲢、鳙鱼生长在淡水湖泊、河流、水库、池塘里。多分布在水域的中上层,是中国特有鱼类,在中国分布范围很广,是池塘养殖及水库渔业的主要对象之一,经济价值较高。盛产于有“中原第一湖”美誉的信阳南湾湖的南湾鱼,就是鲢、鳙鱼,独特的气候条件和优质的水资源孕育出的南湾鱼肉质细嫩、鲜美爽口,年产量达180万kg,是地道的无公害绿色食品。

近年来,信阳市很多养殖鲢、鳙鱼的池塘发生了爆发性出血病,病鱼体表、头部、鱼鳍基部大量出血,一旦发病死亡率可达90%以上。给养殖户造成了很大的经济损失。经鉴定病原为嗜水气单胞菌,目前,对该病多采用化学药物治疗,疗效不是很理想,容易诱导耐药菌株产生,引起环境污染,同时还会引起药物残留。研究表明,疫苗接种是控制养殖水产动物疾病的有效途径之一。然而,采用注射法和浸泡法接种在操作上有着很多的不方便性。口服接种具接种方便、不损伤机体、可用于各种规格的水生动物。但直接口服菌体可能在胃肠中被降解或不能被肠道有效吸收,因而效果不佳。因此,制备一种可口服疫苗来预防嗜水气单胞菌感染十分必要。

利用生物可降解材料如丙烯酸树脂、海藻胶或脂质体等包裹弧菌或杀鲑气单胞菌抗原制成口服疫苗微粒,免疫鱼体后可诱导肠道粘膜免疫和全身性免疫应答。在哺乳动物实验中,利用聚乳酸一乙醇酸共聚物(poly(1actide—CO—glycolide),PLG)包裹抗原制成疫苗微粒,经口服免疫后亦显示明显的免疫保护效应。这些生物可降解材料均可防止抗原在胃肠中被降解。其中,PLG疫苗微粒可制成干粉,保存、使用方便。此外,在哺乳动物实验中还发现PLG具有佐剂效应,可确保低剂量的抗原被提呈,从而诱导粘膜免疫和全身性免疫。本实验制备了含嗜水气单胞菌灭活菌体的PLG疫苗微粒,并以鲢、鳙鱼为实验动物研究这种疫苗微粒的免疫保护效应。

表1 口服疫苗后鲢、鳙鱼的抗体滴度

表2 口服疫苗后肠粘膜抗体滴度

表3 嗜水气单胞菌对鲢、鳙鱼LD50的测定

表4 口服疫苗后感染嗜水气单胞菌后鲢、鳙鱼存活情况

l 材料与方法

1.1 主要试剂和菌株生长条件

PLG(RG 505)为上海某公司产品,聚乙烯醇1788(PVA一1788)为郑州某石化维纶厂产品,亲和素标记的碱性磷酸酶为郑州爱科生物工程公司产品,其余试剂为国产分析纯。嗜水气单胞菌分离自染病鲢、鳙鱼,用胰酶大豆琼脂(TSA)于28℃培养。

1.2 疫苗微粒的制备和检测

采用复乳挥发法制备疫苗微粒。蛋白含量测定采用BCA法,测定前疫苗微粒用3.0mLl mol/LNaOH(含5%SDS)室温溶解24h,室温离心(4,000×g,10 min)收集上清液。

1.3 鲢、鳙鱼的免疫接种

选取体重约为200g的健康鲢、鳙鱼,随机分为2组,即全菌疫苗微粒免疫组及空微粒组,每组鲢、鳙鱼各50尾,每组两个平行。各组鲢、鳙鱼均口服免疫3次,时间间隔为2周,免疫前停饲24h。每次免疫剂量为10mg疫苗微粒或空微粒,分别于初种后第20d,34d,48d随机在每组取鲢、鳙鱼各5尾,采集心脏血液和后肠粘液,于-40℃保存。

1.4 抗体滴度检测

生物素标记的兔抗鲢、鳙鱼Ig 按以下方法制备:注射免疫致敏鲢、鳙鱼的血清经IgM 纯化柱纯化后,收集IgM 并用弗氏完全佐剂乳化,进行家兔免疫,采集家兔抗血清用Protein A/G柱纯化,收集兔抗鲢、鳙鱼Ig 并进行生物素标记。ELISA检测按文献等介绍的方法进行。酶标板用适量灭活菌体悬液包被,第1抗体为适当稀释的鲢、鳙鱼血清或肠粘液,第2抗体为生物素标记的兔抗鲢、鳙鱼Ig。亲和素标记的碱性磷酸酶用来结合第2抗体。以对硝基苯磷酸二钠为显色底物,于405nm测定光吸收值。阴性对照为未免疫鲢、鳙鱼的血清或肠粘液,待测样品与阴性对照的A 比值≥2即视为阳性反应。抗体滴度用稀释度表示,当待测样品A405比值≥2时,以(A样品一A对照)/A对照的比值作为基本稀释度的系数,求出最终的抗体滴度。

1.5 菌株毒力测定

嗜水气单胞菌毒力(LD50)测定在约26℃的水体中进行。100尾健康鲢、鳙鱼(体重约200g)随机分为5组,除对照组腹腔注射无菌PBS外,其余4组均腹腔注射5×108~8×108cfu/g嗜水气单胞菌,观察3周,记录注射菌量及死鱼数,并通过病理检验确定死因是否为嗜水气单胞菌感染。按Bliss 统计法计算LD50。

1.6 免疫保护实验

实验水温约26℃。鲢、鳙鱼第3次口服疫苗微粒或空微粒后第2周(即初种后第42d),用1%(v/v)乙醚溶液进行轻度麻醉。然后腹腔注射400 µL嗜水气单胞菌液(含20 LD50),观察3周。记录死鱼数,并进行病理检验,计算存活率。

1.7 统计学处理

实验数据以平均值±标准差(±s)表示,非配对t检验用于各组的抗体滴度比较,Fisher,s双侧检验用于存活率差异分析,平均存活时间的计算和比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 口服疫苗微粒的特性

利用PLG包裹细菌灭活菌体,制备了菌体疫苗微粒。经显微镜检测表明,疫苗微粒形态基本一致,呈圆球状,直径约10µm。BCA法测定显示,菌体疫苗微粒的蛋白质含量分别为5.67 %±0.34%;蛋白质包裹效率为93.29 %±3.26% ,说明菌体被有效包裹入PLG微粒。

2.2 血清的抗体应答

ELISA法测定了第1次和第2次加强免疫后的鲢、鳙鱼血清。结果表明,全菌疫苗微粒组可检测到明显的血清抗体,并且,在第2次加强免疫1周后(即初种后第34d),疫苗诱导的血清抗体达到最高水平,到第2次加强免疫3周后(即初种后第48d),血清抗体水平明显下降(表1)。空微粒组的3批血清经ELISA检测时,其A405与阴性对照的A405比值均小于2,表明空微粒不会诱导鲢、鳙鱼产生抗嗜水气单胞菌抗体。这些结果表明全菌口服疫苗微粒可诱导鲢、鳙鱼产生血清抗体应答。

2.3 肠粘液的抗体应答

鲢、鳙鱼免疫接种前或接种后,分别采集鲢、鳙鱼肠道后半段的肠粘液,用ELISA法测定肠粘液的抗体水平。结果表明,全菌疫苗组的肠粘液检测到抗体,但抗体滴度远低于血清(表2)。空微粒组的肠粘液则无一例呈阳性反应。由此可见,疫苗微粒可诱导低水平的粘膜抗体应答。

2.4 菌株毒力

在本实验条件下,鲢、鳙鱼经腹腔注射不同细菌剂量后的死亡情况见表3。所有死亡鲢、鳙鱼经病理检均为嗜水气单胞菌感染致死。实验结果经Bliss统计法处理,求得嗜水气单胞菌对鲢、鳙鱼的LD50为3.7×106cfu/g,95 %可信区为1.1×106~1.3×106cfu/g。

2.5 疫苗微粒的保护效应

各组鲢、鳙鱼经3次口服免疫后,腹腔注射20LD50嗜水气单胞菌。接种后第1d,各组鲢、鳙鱼都有部分出现感染症状,但未出现死亡,死亡时间主要在第3d到第8d(表4)。全菌疫苗组及空微粒组的存活率分别为58%及8 %。

3 讨 论

本实验表明,嗜水气单胞菌全菌疫苗可诱导鲢、鳙鱼的免疫应答。口服接种疫苗微粒后,鱼血清和肠粘液均有抗嗜水气单胞菌抗体产,表明鱼肠道可吸收PLG微粒包裹的抗原。鱼类后肠的肠道相关淋巴组织可能是抗原吸收的场所 。

鱼类的血清抗体应答和粘膜抗体应答可能是2种相对独立的免疫应答机制,血清抗体应答属全身性免疫应,粘膜抗体应答为局部免疫应答。一般情况下,只有抗原与肠粘膜表面直接接触,才能诱导肠粘膜免疫应答。某些抗原经适当免疫途径可同时引起血清及粘膜抗体应答,但由于应答机制,血清及粘膜抗体应答水平必然存在差异。本实验也发现,疫苗微粒诱导的血清抗体水平都大大的高于肠粘液抗体水平。

细菌攻击实验表明疫苗微粒具有较好的保护效应。总之,本实验发现嗜水气单胞菌全菌疫苗微粒可诱导鲢、鳙鱼的血清及肠粘液抗体应答,表明疫苗微粒可作为预防嗜水气单胞菌感染的鲢、鳙鱼用疫苗。(参考文献略)

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